Summary
In diesem Bericht zeigen wir ein System zur Isolierung und Kultur Spenderzellen von der Maus Brustdrüse und orthotop Transplantation dieser Zellen in Empfängermäuse zu Stromatumoren analysieren: epitheliale Interaktionen während Mammatumor Entwicklung.
Abstract
Der Einfluss der Stroma-Zellen, einschließlich Fibroblasten auf Mamma-Tumorprogression wurde auch durch den Einsatz von Maus-Modellen dokumentiert, insbesondere durch die Transplantation von Stromazellen und Epithelzellen in der Brustdrüse von Mäusen. Aktuelle Transplantation Modelle oft mit dem Einsatz von immungeschwächten Mäusen aufgrund der unterschiedlichen genetischen Hintergründen von Stromazellen und Epithelzellen. Extrazelluläre Matrices werden oft verwendet, um die zwei verschiedenen Zelltypen für die konsequente Zell-Zell-Interaktionen eingebettet, sondern mit dem Einsatz von Matrigel oder Rattenschwanz Collagen, die immunogene Substrate sind. Das Fehlen von funktionellen T-Zellen aus Mäusen Immunsystem verhindert eine genaue Berechnung der Stromazellen auf Mamma Tumorprogression in vivo, mit wichtigen Auswirkungen auf die Entwicklung von Medikamenten und Wirksamkeit. Darüber hinaus sind immungeschwächte Mäuse teuer, schwer zu züchten und bedürfen einer besonderen Pflege Bedingungen. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir einen Ansatz zur orthotop transplantierten Stromazellen und Epithelzellen in Mäuse aus dem gleichen genetischen Hintergrund, um konsistente Tumorbildung induzieren entwickelt. Dieses System beinhaltet die Ernte normal, Karzinom assoziiert Fibroblasten, PyVmT Mammakarzinom-Zellen und Kollagen vom Spender C57BL/6J-Mäuse. Die Zellen werden dann in Kollagen eingebettet und transplantiert in der Leistengegend Milchdrüsen der weiblichen C57BL/6J-Mäuse. Die Transplantation von Zellen allein PyVmT Form tastbaren Tumoren 30-40 Tage nach der Transplantation. Endpoint-Analyse nach 60 Tagen zeigt, dass Ko-Transplantation mit Fibroblasten erhöht Brusttumor Wachstum im Vergleich zu PyVmT Zellen transplantiert allein. Während Zellen und Matrix aus C57BL/6J-Mäuse in diesen Studien verwendet wurden, kann die Isolierung von Zellen und Matrix und Transplantation Ansatz Mäuse aus verschiedenen genetischen Hintergründen demonstriert Vielseitigkeit angewendet werden. Zusammenfassend kann dieses System verwendet, um molekulare Wechselwirkungen zwischen Stromazellen und Epithelzellen zu untersuchen, und überwindet kritische Einschränkungen bei immungeschwächten Mausmodellen.
Protocol
1. Isolierung und Gewinnung von Spender Kollagen aus C57BL/6J-Mäuse
- Sacrifice reifen normalen weiblichen C57BL/6J-Mäuse mit zugelassenen IACUC Methoden.
- Ernten Sie die Schwänze und saugen in 70% Ethanol für 45 Minuten, um Gewebe zu sterilisieren. Trocknen Sie die Schwänze mit Seidenpapier, in Alufolie wickeln. Bewahren Sie die Schwänze in -20 ° C bis zum Gebrauch.
- Legen Sie die Schwänze in einer sterilen Umgebung wie einer Sterilbank. Mit einer Schere, spaltete sich die Haut an der Schwanzwurzel und lösen sich von der Rute. Entfernen Sie 0,5 bis 1 cm von beiden Enden des Schwanzes und teilen die restlichen Schwanz in drei oder vier Stücke. Präparieren Sie die Sehnen aus dem Schwanz und trennen Sie die Sehnen in einzelne Fasern mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge.
- Übertragen Sie die Sehnenfasern in einen sterilen Behälter und waschen mit sterilem destilliertem Wasser. Transfer-Sehnen vom Schwanz von 5-7 Mäusen zu einer 50 ml konische Röhrchen mit 35 ml sterilem deionisiertem Wasser mit 50 Einheiten / ml Penicillin Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin und 0,034 N Essigsäure verdünnt aus einer Stammlösung von Eisessig (17 N). Legen Sie auf Wippe bei 4 ° C für eine Woche zu extrahieren das Kollagen.
- Spin down Schutt in einer Tischzentrifuge bei 3000 g für 15 Minuten. Überstand, ca. 30 ml auf zwei Polycarbonat-Röhren für die Beckman 50,2 Ti Rotor und Spin bei 35.000 g (ca. 17000 UpM) angepasst für 1 Stunde.
- Das Volumen des Überstandes müssen gesenkt werden, um eine Konzentration von 1-2 mg / ml zu erreichen. Übertragen Sie den Überstand auf eine Ultracel 50 k Amicon Filtrationseinheit und Spin in einer Tischzentrifuge bei 3000 rpm für 15 bei 4 ° C. Das Filtrat in einen sterilen konischen Rohr und speichern. Wiederholen Sie die Zentrifugation bis das Volumen auf 5-6 ml reduziert wird.
- Lesen Sie die Protein-Konzentration. Wir verwenden eine Standard-Bradford (Biorad) mit BSA-Standards (Biorad) und unverdünnten Proben. Messen Sie eine Probe Ihres Filtrat, als negative Kontrolle.
- Weitere für die Reinheit der Extraktion überprüfen, indem die Lösung eine Probe von gereinigtem Kollagen auf einem 6% SDS-Polyacrylamidgel, 10 Bahnen, 1,5 mm Geldicke. Bereiten 20 ug der Probe in 30 ul 1x SDS-PAGE-Ladepuffer mit 63 mM Tris HCl 10% Glycerin, 2% SDS 0,0025% Bromphenolblau in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Bereiten Sie eine äquivalente Menge an Protein aus Rattenschwanz Kollagen Typ I als positive Kontrolle. Darüber hinaus bereiten eine Reihe von BSA-Standards mit 2,5, 5, 10, 20 ug in PBS und 1X Ladepuffer verdünnt. Kochen Sie die Proben bei 95 ° C für 5 Minuten.
- Lassen Sie die Proben kühl und kurz Mikrofuge (maximale Geschwindigkeit für 10 Sekunden) auf Spin-Down Kondensation.
- Laden Sie die Proben Proben zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker. Legen Sie zum Beispiel 5 ul Kaleidoscope Biorad-Protein-Standard. Elektrophorese bei 150 Volt für etwa 1 Stunde oder bis der Farbstoff vor Erreichen der unteren.
- Entfernen Sie das Gel und Flecken in Coomassie-Blau-Puffer. Bereiten Sie diesen Puffer durch Mischen von 2 g Coomassie-Blau, 75 ml Eisessig, 500 ml Ethanol in einem Gesamtvolumen von 1000 ml mit de-ionisiertem Wasser. Auch bereitet die gleiche Menge an entfärben Puffer mit dem Rezept nur ohne Coomassie-Blau-Reagenz. Decken Sie die Gel mit einem ausreichenden Volumen für Coomassie-Blau und Ort auf einer Wippe.
- Rock sanft für 1 Stunde bei RT und dekantieren Sie den Fleck. Ersetzen Sie die Entfärbung Lösung, wenn es dunkel blau wird. Detain das Gel über Nacht oder bis die einzelnen Bands sind auf dem Gel gelöst. Suchen Sie zwei Kollagenpfropfen Bands (Molekulargewichte = 90 kDa und 130 kDa) und beachten Sie die Stärke der Banden gegen die Normen und Kontrollen. Bild des Gels mit einem Gel-doc-System, falls erforderlich.
2. Isolierung und Kultivierung von Spender Mammakarzinom-Zellen und Fibroblasten, die aus normalen und PyVmT C57BL/6J-Mäuse
- Sacrifice Alter abgestimmt weiblichen normal oder PyVmT transgenen Mäusen nach 10 Wochen alt sind, wenn die Tumore deutlich und greifbar in PyVmT transgenen Mäusen mit zugelassenen IACUC Methoden sind.
- Setzen Sie die Maus auf dem Rücken auf einer flachen Oberfläche und Immobilisierung der Gliedmaßen mit Klebeband Kleber.
- Machen Sie ein umgedrehtes T Einschnitt zwischen den Brustwarzen der Brust-und Leistengegend Brustdrüse und ziehen Sie den Hautlappen zurück in die Milchdrüsen aussetzen. Entfernen Sie die Brust Gewebe und Hackfleisch in kleine Stücke mit chirurgischer Schere.
- Es werden 100 ml einer enzymatischen Verdauung Cocktail enthält: 200 mg Trypsin, 500 mg Kollagenase, 4 mg DNAse, 100.000 Einheiten Hyaluronidase in sterile PBS und Antibiotika über Nacht auf Eis und anschließend für 3 h bei 37 ° C.
- 10 ml PBS mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) zu jeder Probe und Zentrifuge Zellpellet in einer Tischzentrifuge bei 1500 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Vorsichtig absaugen Überstand und Zellpellet in 5-7 ml PBS/10% FBS. Wiederholen Sie den Spin und waschen zwei weitere Male.
- Zellpellet in 10 ml DMEM mit 10% FBS mit 50 Einheiten / ml Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin auf 10 cm Schalen mit Kollagen Typ I. Zur Beschichtung Platten mit Kollagen beschichtet, verdünnt das Kollagen 1 ml (mit Lager 1,5 mg / ml) in 39 ml 0,02 N Essigsäure in sterilem destilliertem Wasser oder PBS verdünnt. Pipettieren Sie 5 ml Kollagen funktionierende Lösung auf 10 cm-Platten. Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten lang. Absaugen überschüssige Kollagen. Parafilm ungenutzte Platten und lagern bei 4 ° C für eine Woche.
- Ändern Sie die Medien von 2 bis 3 Mal pro Woche. Erfolgreiche Verdauung von Geweben wird durch das Vorhandensein von epithelialen Herden von spindelförmigen Fibroblasten Zellen umgeben charakterisiert werden.
- Trennen Sie die Fibroblasten und Epithelzellen durch selektive tryspinization. Saugen Sie das Medium und die Zellen mit PBS einmal. Pipettieren von 1 ml 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA auf Zellen und bei Raumtemperatur inkubieren. Fibroblasten sind eher lose anhaftenden als Epithelzellen. Prüfen Sie, ob Fibroblasten Ablösung unter dem Mikroskop nach 2 Minuten; Zellen sollten in Suspension schwimmende oder aufgerundet, während epithelialen Herden sollte noch an der Oberfläche einzuhalten.
- Leicht auf den Teller, die Fibroblasten und sanft Pipette 10 ml serum-haltigem Medium in der Schale lösen, die Fibroblasten zu entfernen.
- Pipettieren Sie die Medien mit Fibroblasten in einer 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge, wie in Schritt 5 beschrieben). Replate diese Zellen auf Kollagen beschichtet 10 cm Geschirr und wiederholen Sie den Vorgang, bis selektive Trypsinierung Fibroblasten und Epithelzellen völlig getrennt sind.
- Überprüfen Sie für die Zell-Reinheit von Immunfluoreszenzfärbung für epitheliale Marker wie CK14 und CK18 und Fibroblasten Marker wie alpha smooth muscle actin (α-SMA).
3. Immunfluoreszenzfärbung von kultivierten Zellen
- Legen Sie Deckgläschen in 6 cm Schalen. Sterilisieren durch UV-Bestrahlung für 5 bis 10 Minuten in einer Sterilbank.
- Coat das Deckglas mit 1-2 ml der Arbeitszeit Lager Kollagen-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Absaugen über.
- Trypsinize und Platte 200.000 Epithelzellen oder Fibroblasten pro Probe. Fügen Sie 3-5 ml der komplette Medien-und inkubieren für 24 Stunden.
- Saugen Sie die Medien, waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren in eiskaltem Methanol bei -20 ° C für 7 Minuten.
- Wash-Zellen mit PBS zweimal, um Ethanol und Block mit 1-2 ml PBS mit 1% FBS für 1 Stunde bei RT zu entfernen.
- Mit einer Pinzette entfernen Sie die Deckgläser und in einem großen flachen Behälter mit Parafilm oder andere hydrophobe Oberfläche bedeckt.
- Verdünnen Sie die folgenden primären Antikörper 1:100 in Blocking-Lösung: anti-smooth muscle actin (α-SMA, Anti-CK14 (Epithelgrundfläche Marker), anti-CK18 (Luminalepithelkompartiment Marker).
- Je 100 ul von Antikörpern direkt auf die Deckgläschen für 1 Stunde bei RT. Inkubieren einer separaten Deckglas von Zellen in Blocking-Lösung; diese Probe wird als sekundärer Antikörper Kontrolle dienen.
- Absaugen Antikörper und Pipette 1 ml PBS direkt auf dem Deckglas zu waschen. Absaugen und wiederholen Sie 3-5 mal.
- Verdünnen Sie die folgenden Sekundärantikörper in Blocking-Lösung: Anti-Maus-Alexa 488 bei 1:100, anti-Maus bei 1 biotinylierten: 500,-Anti-Maus-Alexa-568.
- Wickeln Sie den Behälter mit dem Deckgläschen in Alufolie. Je 100 ul der entsprechenden Sekundär-Antikörper direkt auf den Deckgläschen: α-sma mit Anti-Maus-Alexa 568, CK 14 Färbung mit Anti-Maus-biotinylierten und CK18 mit Anti-Maus-Alexa 488. Umschlag der Container, die Proben von sichtbarem Licht zu schützen.
- Absaugen Antikörper und waschen mit PBS, wie in Schritt 9). Lassen Sie die Proben in PBS, mit Ausnahme von CK14 Färbung.
- Verdünnen Streptavidin konjugiert mit Alexa 568 1:500 in PBS. Inkubieren Sie die CK14 gefärbten Proben mit strepatividin-Alexa 568 für 30 Minuten bei RT im Dunkeln. Wash in PBS, wie in Schritt 9)
- Verdünnen Sie DAPI 1: 500 in PBS. Saugen Sie das PBS aus den Proben und Inkubation mit DAPI für 10 Minuten RT im Dunkeln.
- Spülen Proben mit PBS. Je 100 ul der Prolong anti-fade Reagenz auf Glas-Objektträger, schalten Sie das Deckglas über, so dass die Zellen sind mit Blick auf den Glasträger. Kippen Sie das Deckglas zu einem Winkel vorsichtig Kontakt mit den Montage-Medien.
- Bild der Proben mit einem Immunfluoreszenz-Mikroskop. Halten Sie die Proben im Dunkeln auf die Immunfluoreszenz-Signal, das dauert ca. 2 Wochen schützt.
4. Herstellung von Kollagen eingebetteten Zellen für die Transplantation
- Zum Einbetten von Zellen in Kollagen, ist es notwendig, den pH-Wert des Kollagens niedriger, um die Polymerisation durch Mischen des Kollagens mit einer Einstellung Lösung zu erreichen. Bereiten Sie die Einstellung Lösung durch Mischen von 100 ml 10X Earl Balanced Salt Solution (EBSS) mit 2,45 g NaHCO3, 7,5 ml 1 M NaOH und 42,5 ml sterilem destilliertem Wasser. Weitere sterilisieren mit einer Flasche top 0,22 Mikron-Filter-Einheit an eine sterile Flasche. <li> Mix das Kollagen (stock Konzentration 1 mg / ml) mit der Einstellung Lösung bei einem Ausgangs-4: 1-Verhältnis. Für eine Transplantat-Mix 100 ul von Kollagen mit 25 ul Einstellung Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen. Vortex kurz oder Pipette die Probe nach oben und unten, um die Probe gründlich zu mischen.
- Add Kollagen oder Einstellung Lösung bei 5-10 ul-Schritten und gründlich mischen, bis das Phenol roten Farbstoff in das Gemisch Änderungen an einem leicht rosa bis orange Farbe, was auf einen neutralen pH-Wert. Eine gelbe Farbe zeigt sauren pH-Wert während dunkelrosa spiegelt basischen pH-Wert. Halten Sie die Mischung auf Eis, um die Polymerisation zu verhindern.
- Entfernen Sie die Fibroblasten und Epithelzellen von der Platte durch Trypsinierung. Zuerst saugen die Medien-und abwaschen mit 5 ml PBS. Pipettieren von 1 ml 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA in HBSS pro Platte. Inkubieren Fibroblasten bei RT für 2-5 Minuten. Inkubieren Epithelzellen bei 37 ° C für 2-6 Minuten. Tippen Sie auf die Platten vorsichtig, um die Zellen zu lösen. Überprüfen Sie für die Ablösung mit einem microscope.Quench das Trypsin durch Pipettieren 9 ml Vollmedium auf der Platte und den Transfer der Zellen in ein steriles 15 ml konischen Rohr.
- Nehmen Sie 50 ul und zählen Sie die Zellen durch Zählkammer. Beachten Sie das Gesamtvolumen der Zellen in jeder Röhre (ca. 10 ml).
- Pellet die Zellen bei 1500 rpm für 5 min bei RT. Saugen Sie das Zellpellet und Zellen bis zu einer Konzentration von 100.000 Zellen/100 ul. Zum Beispiel, resuspendieren 500.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 500 ul komplette Medien.
- Mix 250.000 Stromazellen (250 ul) und 100.000 Tumorzellen (100 ul) in ein separates Röhrchen. Microfuge 10 Sek. 1000 rpm, Überstand entfernen durch Pipettieren. Dann werden 50 ul der eingestellten Kollagenlösung zu den Zellen. Pipet rauf und runter, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Pipettieren von 50 ul in einem sterilen 6 cm Gewebekulturplatte bilden eine kreisförmige Tropfen. Inkubieren des Transplantats bei 37 ° C für 10 Minuten zur Polymerisation.
- Vorsichtig mit 5 ml komplette Medien in der Platte durch Kippen der Platte in einem Winkel und langsam Pipettieren die Medien von einer Seite der Platte. Neigen Sie den Teller herum, bis die Medien über das Transplantat.
- Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37 ° C. Transplant sofort.
5. Orthoptische Transplantation von Kollagen eingebetteten Zellen in C57BL/6J-Mäuse
- Fertigen Sie ein dünner Glasstab für die Transplantation. Hitze ein Glas Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner. Mit einer Pinzette, strecken das Ende der Pipette heraus auf 2-3 mm Dicke. Abkühlen lassen, und sterilisieren von 70% Ethanol.
- Sterilisieren Sie die folgenden chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren und 70% Ethanol: feine chirurgische Schere, stumpf chirurgische Scheren, Pinzetten stumpf, dünne Pinzette, Wund-Clips, Wunde Grundnahrungsmittel
- Anesthetize Maus mit mit 2-3% Isofluran mit einem Isofluran Aufräumen Maschine. Die durchschnittliche O 2 Durchfluss verwendet wird 1 L / min durch die Nase Kegel.
- Legen Sie die Maus auf den Rücken und unbeweglich die Gliedmaßen mit Klebestreifen oder sonstigem Kleber. Entfernen Sie die Haare mit chemischen Haarentferner wie Nair. Sterilisieren der Bauch mit Baumwolle swabbing alternativ zwischen 70% Ethanol und betadine in einem Ziel-artig.
- Halten Sie ein Teil der Haut durch die Brustdrüse mit einer stumpfen Zange mit einer Hand. Mit der anderen Hand, um mit stumpfen chirurgische Scheren eines umgedrehten T-Einschnitt zwischen den # 9 und # 10 Brustwarzen oder # 4 und # 5 Brustwarzen der Leistengegend Milchdrüsen zu machen, um die Milchdrüsen aussetzen.
- Machen Sie eine Tasche Schnitt unter den Lymphknoten oder mammaria mit kleinen chirurgischen Frühjahr Schere.
- Entfernen Sie die Kollagen-Transplantat aus dem Gewebe Kulturschale mit einer Pinzette. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Kollagen Transplantats durch vorsichtiges Tupfen auf einem sterilen Tuch und schieben Sie die Kollagen-Transplantat vollständig in die Tasche mit einem dünnen Glasstab.
- Suture die Hautlappen mit # 2 gut resorbierbare Fäden oder Wunde Heftklammern.
- Lassen Sie die Maus in den Käfig zu erholen.
- Überwachen Sie die Mäuse zweimal wöchentlich auf ein Minimum, Abtasten von Tumoren. Sacrifice die Mäuse, wenn die Tumore 1 cm im Durchmesser erreichen. Ernte Gewebe für die Analyse.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Isolierung und Extraktion von Kollagen aus C57BL/6J-Mäuse
Diese Verfahren wurden von 1 angepasst. Extraktion von Kollagen-Protein 5 bis 7 Mäuseschwänzen ergibt ca. 1-1,5 mg / ml in einem 6 ml Endvolumen oder 6 bis 9 mg Protein. Durch coommassie Flecken, Streifen entsprechend 90 kDa und 130 kDa sind in den Gassen mit Mustern aus Mäuseschwänzen extrahiert geladen erkannt, was die Anwesenheit von Kollagen Typ I und Pro-Kollagen (Abbildung 1).
Isolierung und Kultivierung von Mammakarzinom-Zellen und Fibroblasten, die aus normalen und PyVmT C57BL/6J-Mäuse.
Die Verfahren wurden aus 2 angepasst. PyVmT Karzinom-Zellen und Fibroblasten können durch Unterschiede in der Morphologie der Zellen und die Expression von bestimmten epithelialen und mesenchymalen mar unterschieden werdenKERS. PyVmT Karzinom-Zellen werden durch Kopfsteinpflaster Form und co-express CK18, ein Luminalepithelkompartiment Marker und CK14, eine basale epitheliale Marker, aber nicht ausdrücken, α-sma (Abbildung 2) identifiziert. Mammary Fibroblasten sind größere Zellen mit einem spindelförmigen Phänotyp und exprimieren große Mengen von α-sma aber nicht ausdrücken CK14 oder CK 18 (Abbildung 2). Diese Daten zeigen mehr als 95% Reinheit der Zellen für Fibroblasten und Epithelzellen mit dem beschriebenen Verfahren.
Orthoptische Transplantation von Kollagen eingebetteten Zellen in C57BL/6J-Mäuse
Diese Verfahren wurden von 3, 4 angepasst. Transplantation Empfänger Mäuse werden getötet, wenn die Tumore in beiden experimentellen Gruppe 1,0 cm im Durchmesser, oder etwa 60 Tagen zu erreichen. Während die Transplantation von Zellen allein PyVmT Ergebnisse in tastbaren Tumoren nach 30 bis 40 Tagen erreicht eine mittlere Tumormasse von 0,335 Gramm auf 60 Tage, was darauf hinweist Ko-Transplantation von PyVmT Karzinomzellen mit Mamma-Fibroblasten führt zu einer mittleren Tumormasse von 0,630 Gramm, Weiterentwicklung des Tumorwachstums von Fibroblasten (Abbildung 3).
Abbildung 1. Coomassie-Färbung Analyse von Kollagen Typ I-Extraktion aus Mäuseschwänzen. BSA (~ 66 kDa) ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Gewerbliche Rattenschwanz Collagen (20 ug Protein) und gereinigtes Maus Schwanz Kollagen (20 ug Protein) sind durch den Kasten (~ 130 kDa, ~ 90 kDa Proteine) angegeben. Std = Molekulargewicht Standard.
Abbildung 2. Immunfluoreszenzfärbung von Spender PyVmT Mammakarzinom-Zellen und Fibroblasten. Panels a und b PyVmT Mammakarzinomzellen immungefärbt auf Antikörper gegen CK14 und CK18. Panel-c stellt Fibroblasten mit Antikörpern gegen α-sma gefärbt. Bilder mit DAPI-Overlay bei 20-facher Vergrößerung dargestellt.
Abbildung 3. Mammatumor Entwicklung in C57BL/6J-Mäuse in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Fibroblasten. Brusttumore wurden von Mäusen mit PyVmT Karzinom-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von Mamma-Fibroblasten transplantiert geerntet und gewogen. Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts. N = 6 pro Gruppe.
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Discussion
Die funktionalen Beitrag von Fibroblasten in der Tumorprogression ist durch die Transplantation Modellen nachgewiesen, in denen Karzinome assoziiert Fibroblasten mit gutartigen Brustepithelzellen führt zu einem erhöhten Tumorwachstum und Invasivität 5 Co-transplantiert. Herkömmliche Ansätze der Transplantation haben die Verwendung von SCID oder Nacktmäusen, die Zusammenarbeit der Transplantation stromalen und epithelialen Zellen aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen Maus oder verschiedene Arten. Immungeschwächten Mäusen fehlt Funktions-T-Zellen, die eine entscheidende Rolle spielen bei der Vermittlung von Anti-Tumor-Immunität durch Erkennung von Tumor-spezifische Antigene und richten anschließend von Tumorzellen hemmen Metastasierung 6. Die jüngsten Studien haben gezeigt, dass Fibroblasten wichtige Regulatoren der Immunantwort Zellrekrutierung 7, 8, was darauf hinweist, dass die Entwicklung neuer Ansätze zur stromalen Studie: epithelialen Zell-Interaktionen sind, um besser zu verstehen, die Mechanismen der Brusttumor Progression notwendig. Die skizzierten Verfahren demonstrieren eine zuverlässige Methode, um: Isolierung und Kultur Brustepithelzellen und mesenchymalen Zellen und orthotop Transplantation dieser Zellen in immunkompetenten Mäusen zu Brusttumoren bilden. Mit dem beschriebenen Verfahren haben wir mehr als 40 Mäuse mit verschiedenen experimentellen Gruppen und verschiedene Endpunkte mit über 97% erfolgreiche Transplantation Rate, was die Zuverlässigkeit dieses Systems gepfropft. Die Auswirkungen des Milch-Fibroblasten auf das Tumorwachstum in diesem System stehen im Einklang mit zuvor veröffentlichten Studien mit subrenal Kapsel Transplantation von Fibroblasten mit Mamma-Karzinom-Zellen 9. Wir haben einige Bedenken mit dem System in diesem Bericht. Wenn die Konzentration der entstehenden Lager ist zu niedrig für die Einbettung von Zellen kann eine weitere Konzentration des Kollagens auf eine niedrigere Lautstärke oder isolieren mehr Kollagen aus zusätzlichen Schwänze. Um eine konsistente Tumorbildung, ist es wichtig, die Zellen gleichmäßig in der Kollagen-Stecker während des Kollagens durch Pipettieren zerstreuen und das Auftreten von Blasen in der Kollagen-Stecker.
Die niedrigen Hintergrund der Tumorbildung in C57BL/6J-Mäuse 10, 11 ermöglicht es uns, die funktionelle Beitrag der spezifischen Onkogenen oder Inaktivierung von Tumor-Suppressoren in stromalen untersuchen: epitheliale Interaktionen während Mammatumor Progression. Expression spezifischer Onkogene und Tumor-Suppressoren können in Stromazellen oder Epithelzellen durch stabile Expression von siRNAs zum Beispiel vor einer Transplantation verändert werden. Da Primärzellen mit ständigen Passagieren senesce, ist die genetische Manipulation von kultivierten Zellen leichter, wenn die Zellen unsterblich sind, zum Beispiel durch spontane Immortalisierung oder Expression eines Onkogens 12, 13, 14, 15. Immortalisierung von verschiedenen Stromatumoren Zelltypen mit Makrophagen und Endothel-Zellen 16, 17, 18 erreicht. Immunfluoreszenzfärbung für bestimmte stromalen und epithelialen Marker ergab hochreines Populationen von Fibroblasten und Epithelzellen in diesen Studien isoliert. Allerdings kann die Identifikation der Kontamination Zellpopulationen erfordern den Einsatz von Flow Sortierung zu weiteren Reinigung der gewünschten Zellpopulationen. Als Alternative zur Immortalisierung und Genmanipulation in der Kultur, haben die Forscher auch spezifische Zelltypen aus transgenen Mäusen Durchströmung Sortierung isoliert und direkt transplantierten diese Zellen in Mäusen für die Untersuchung von verschiedenen Geweben, einschließlich der Brustdrüse 19, 20. Dieser Ansatz Dieser Ansatz führt zu physiologisch relevanten Primärzellen, sondern erfordert die Isolierung von Zellen aus Mäusen jeder Zeit. Allerdings sind die Versorgung der Zellen und die Reinheit der Zellpopulationen abhängig von der Fülle der Zelltyp und über die Zahl der Mäuse zur Verfügung. Diese Herausforderungen können mit der Transplantation von Tumorzellen in Mäuse mit fluoreszierenden Reporter wie Aktin-GFP-Mäusen 21 zu umgehen sein. In diesem System würde man in der Lage sein, um die Auswirkungen des gesamten Stroma auf die Tumorprogression zu untersuchen, aber nicht unterscheiden, den Beitrag der spezifischen Stromazellen. Jeder der Ansätze wird mit spezifischen Vor-und Nachteile und kann mit dem System in diesem Bericht beschrieben, kombiniert werden, je nach der Ermittler muss. Darüber hinaus kann das beschriebene System angepasst oder geändert werden für die Transplantation in verschiedenen genetischen Hintergründen, die Transplantation von verschiedenen Stromatumoren Zelltypen und Brustepithelzellen in unterschiedlichen Staaten der Bösartigkeit, um festzustellen, wie diese verschiedenen Variablen Stromatumoren beeinflussen: epitheliale Interaktionen und anschließende Tumorprogression.
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Disclosures
Tierversuche:
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die IACUC Ausschuss an der University of Kansas Medical Center eingerichtet durchgeführt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde durch von NIH / NCI Grantnummer R00 CA127357 und der University of Kansas Cancer Center Endowment finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N mice | Harlan Laboratories | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson Laboratory | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR international | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-001 | |
| amphotericin | Fisher Scientific | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | EMD Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman Coulter Inc. | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher Scientific | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma-Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher Scientific | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | ||
| hyalronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Bio-Rad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR international | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector Laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher Scientific | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher Scientific | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A406P 4 | |
| betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher Scientific | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher Scientific | 12031-07 |
References
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Medina, D., Kittrell, F. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M.
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O'Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
