直接进入成年斑马鱼的肾细胞移植

Summary

细胞移植是一个研究组织的再生和发展疾病的细胞疗法的基本技术。在这里我们展示一个显微外科技术，允许到成年斑马鱼的肾脏的基因标记的细胞直接移植。

Abstract

再生医学的基础上，干细胞或祖细胞移植到受损的组织， ^具有潜在的治疗1慢性疾病的范围广泛。然而，大多数器官是不容易接触，必然需要制定手术的方法来获得这些结构。在这个视频文章中，我们描述了，直接进入成年斑马鱼，一个流行的模型来研究再生^和疾病2肾移植细胞的方法。收件人鱼是预先条件辐照抑制免疫排斥反应注射的细胞^3。我们演示了如何在头肾，可以通过直接在器官的细胞注射，在鱼的侧面的外侧切口暴露。使用荧光标记的全肾骨髓细胞，其中包括一个肾功能和造血前体的混合人口，我们表明，肾祖细胞可以嫁接，并分化成新的肾组织 - 任何基于细胞再生治疗的金标准。适应这种技术可以提供肾脏以及其他内脏器官和纯化干细胞或祖细胞和/或小分子，进一步增强了作为一个通用的模型来研究再生医学的斑马鱼。

Protocol

1。空调的非转基因收件人鱼类。

1. 选择在系统中用于移植的最大公鱼。
2. 将在0.02％Tricaine的鱼（pH值7），约3分钟，或直至它停止游泳，但没有这么长，心脏停止跳动。
3. 麻醉鱼湿纸巾放在一条长凳上方。
4. 使用胰岛素注射器针头2​​0 UL水成鱼的腹腔腔注入庆大霉素的40微克。对于肾功能再生的研究，这一步很重要，诱使一个有利的环境，增强植入。
5. 鱼放入水系统的恢复。
6. 鱼可被驯服的和非常敏感的震动等外部刺激。经过3个小时的恢复，治疗25伽玛射线的灰色的鱼。
7. 将没有食物移植前3天的鱼放回系统。

2。祖供体细胞的制备，用荧光标记（EGFP或者mCherry）基因标记。

1. 手术过程前，准备捐助移植的细胞，并保持他们在冰上。
2. 对于肾功能的研究中，我们使用全肾从TG（cdh17 EGFP）的骨髓细胞转基因株系，其中包含肾脏和造血祖细胞。这些祖细胞的基因标记，并仅表达EGFP的，如果他们嫁接和肾小管上皮细胞分化成。也可用于其他类型的标记的祖细胞，如造血干细胞或TG（fli1a：EGFP）angioblast祖细胞移植的TG（SCL：EGFP ）。
3. 放置5分钟，他们在0.2％Tricaine安乐死3成年转基因鱼。
4. 使用消毒刀片去除头部和尾部，和解剖剪刀，沿腹方一个正中切口。
5. 在一个立体，删除所有在腔体内，包括镊子鱼鳔的五脏六腑。不小心取出肾脏，这是一个单位和色素的器官，腔背墙。
6. 接下来，从背墙解剖肾脏，放入1.5 mL离心管含300冷磷酸盐缓冲生理盐水辅以2％胎牛血清（1X PBS / 2％FCS）UL。
7. 使用杵剪切肾脏，直到它变得同质化。
8. 将一个50毫升猎鹰管内40 UM细胞过滤器和转移的细胞过滤器上的电池解决方案，让松散的细胞进行筛选，通过猎鹰管。
9. 使用杵轻轻涂抹，留在过滤器上，进一步打破了细胞组织的大块。
10. 留在“猎鹰”管细胞溶液，并用1.2毫升的1X PBS / 2％FCS的过滤器，以收集过滤器的残余细胞。
11. 转让4 ° C时，300 RCF 5分钟到一个新的1.5 mL试管和离心的电池解决方案。
12. 用1.5 mL的1X PBS / 2％FCS中清洗细胞沉淀，并通过一个新的过滤器，过滤掉粘细胞的团块，离心再次。
13. 200 UL的1X PBS / 2％FCS重悬细胞沉淀，并转移到PCR管。
14. 离心机PCR管“（4℃，300 RCF，1分钟），除去上清液。
15. 重悬细胞中的残留上清获得2​​-5 UL最终体积和存储在冰上。
16. 最后蜂窝产量约200万个肾细胞。
17. 计数与血球细胞的数量，并调整浓度至5 ^× 10 5细胞每微升。

3。汉密尔顿注射器装入电池解决方案。

1. 汉密尔顿注射器无菌水冲洗3次。
2. 注射器冲洗干净，用75％乙醇3倍。
3. 注射器冲洗用1X PBS / 2％FCS的3倍。
4. 1 UL细胞溶液中含有约5 × ^{10 5}细胞注射前，然后装入注射器。

4。直接入肾移植的祖细胞。

1. 在0.02％Tricaine的鱼约3分钟，或直至停止移动，但不会太长，心脏停止跳动的麻醉空调收件人鱼。
2. 立体显微镜下，奠定了纸巾上，头向左侧，腹侧的鱼，以干燥移植方面。
3. 然后滚鱼揭露干边。
4. 使用消毒镊子，取出立即去鳃后在该地区的尺度。
5. 用手术刀在这方面的一个1厘米中线外侧切口，同时稳定的组织用镊子。
6. 使用镊子，公开的组织，同时继续深度不够，使切口揭露头肾。
7. 如果有大量出血，防止肾脏的可视化，euthenize鱼，并开始与其他收件人鱼。
8. 虽然撬组织公开揭露头肾，头肾直接注入1单元解决方案UL。
9. 然后，在同一时间正在检索注射器针头，松开镊子，使组织分为放回原处，以防止泄漏注射的细胞。
10. 握住缝合针一针驱动程序和皮尔斯通过切口两侧的肌肉。
11. 铁2节，并切断多余的缝合。只有一个单一的缝合需要一个1厘米的切口。
12. 包含5个小时的百万分之10的Tricaine提供一个平静的镇痛效果的鱼放置在鱼水之鱼。
13. 将系统恢复正常喂食鱼背。
14. 经过7-18天的恢复，我们解剖鱼和生活EGFP荧光分析肾祖细胞植入。

5。代表性的成果：

移植的总体战略是在图1所示。对于我们的肾脏研究，肾脏的解剖和EGFP荧光分析。被检测为早7天移植后的肾祖细胞植入和分化。由多个集群的EGFP ⁺肾上皮细胞（图2）存在，这是显而易见的的。移植后18天，我们发现，平均24 ^EGFP +肾，这表明，供体细胞已经形成了新的肾组织（图3 ）。为了证明长期植入，我们解剖一个收件人鱼59天移植后（图4）。这种鱼有许多肾单位，在注射部位（红色箭头），除了在遥远的地方（白色箭头）的多个肾，表明肾祖细胞迁徙。这种技术是更快和更有效相比，当细胞注射进入血液循环通过心脏，它需要大约3个月检测植入。

图1。辐照抑制细胞移植的免疫排斥反应的移植。非转基因的收件人鱼的整体计划。三天后，切口是鱼和捐助者的祖细胞的侧翼暴露的头肾注入。关闭切口缝合和鱼放入回收系统。收件人鱼肾脏在稍后的时间点解剖和分析，植入和祖活动。

图2。祖细胞植入后七天 。肾祖细胞植入头肾在移植后7天注射方检测，集群的EGFP ⁺肾小管上皮细胞的存在（插图-放大查看）确定。

图3。祖细胞植入后18天 ，移植后18天之后，我们发现24 EGFP的平均捐助者派生肾（插入-放大个人^EGFP +肾） 。

图4。植入后59天祖细胞的迁移 。我们继续检测祖细胞移植后长期植入，即使经过59天的（红色箭头头） 。在稍后的时间点，捐助派生肾站点检测到远离注射液（白色箭头头）的网站，与祖细胞的迁移一致。

Discussion

细胞移植技术是再生研究的关键，是黄金标准测量干细胞活性测定。在这里，我们报告，直接进入成年斑马鱼肾移植的细胞，以确定干细胞和祖细胞的活性的方法。此过程涉及通过一个切口，肌肉，头肾，其次是直接注射入肾细胞暴露。封闭，单一的缝合切口和经营鱼有90-100％的存活率。在我们的实验，检测嫁接肾祖细胞移植的鱼在80-100％，移植后7天。这种技术的一个限制是，切口附近的背主动脉，可以很容易地通过手术刀破裂。然而，一旦掌握，可减少出血发生率小于1％。适应我们的方法可以提供其他类型的细胞（血，间质或血管）以及小分子对肾脏。这项技术的发展将有助于推动再生研究，并允许干细胞和祖细胞的潜力，在体内进行评估。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G