小胞体は、タンパク質の生合成とカルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている。私たちは、私たちはCa2 +のリークチャネルの役割に対処し、それらの推定調節機構を特徴づけることを可能にする実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa2 +イメージングを行います。
哺乳類細胞では、小胞体(ER)が1シグナリング、カルシウムだけでなくタンパク質の生合成において重要な役割を果たしている。 ER膜のヘテロSec61複合体はERの内腔への新規合成ペプチドの水性パスを提供します。様々な研究室から最近の研究では、このヘテロ複合体はまた、一過性のCa 2 +リークチャネル2-8を形成する可能性が示唆された。この概念のための重要な観察 は、ピューロマイシンは、+ ERからのCa 2の一時的な放出につながることによってリボソームとSec61複合体からの新生ポリペプチドのそのリリースでした。さらに、ER内腔タンパク質BIPがSec61複雑な9,10のレベルでのイオン透過性を防止するために関与していることがin vitroで観察されていた。私達は私達が直接潜在的なのCa 2 +リークチャネルとしてSec61複合体の役割に対処するため、その推定調節機構は11月13日特徴付けることができる実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa 2 +イメージング13を組み合わせたもの。細胞はSEC61A1遺伝子またはネガティブコントロールsiRNAを、それぞれ、符号化及び非翻訳領域(UTR)に対して向けられるのsiRNAで処理されています。相補性解析では、細胞は野生型SEC61A1遺伝子のsiRNAによる耐性発現を可能にするIRES – GFPベクターで同時トランスフェクトされています。その後、細胞は細胞質ゾルのCa 2同時に変更+蛍光顕微鏡を介して細胞数の濃度を監視するメトリックのCa 2 +インジケーターフラ-2を使用してロードされます。細胞質ゾルのCa 2の連続的な測定は、+また、ピューロマイシン、小分子阻害剤、およびCa 2タプシガルギン+漏れなど様々な薬剤の影響を評価することができます。この実験系では、この受動的なのCa 2 +流出を制限するタンパク質とメカニズムを特徴づける様々な細胞型、IIのERからパッシブのCa 2 +流出の異なる小胞体膜タンパク質の寄与)を評価する)私に私たちのユニークな機会を与え、 ⅲ)関連するコンポーネントの病気リンクされている変異の影響を検討する。
哺乳類細胞では、小胞体(ER)は、カルシウムシグナル伝達だけでなく、タンパク質生合成において重要な役割を果たしている。ここで、我々は、私たちは直接つの潜在的なのCa 2 +リークチャネルの役割に対処するため、その推定調節機構13を特徴付けることができる実験系を記載している。この実験系では、この受動的なのCa 2 +流出を制限するタンパク質とメカニズムを特徴づける様々な細胞型、IIのERからパッシブのCa 2 +流出の異なる小胞体膜タンパク質の寄与)を評価する)私に私たちのユニークな機会を与え、 ⅲ)関連するコンポーネントの病気リンクされている変異の影響を検討する。
我々は唯一の生存細胞を分析する必要があるとその全体的な生存率が80%以上でなければならないことに注意してください。したがって、細胞の生存率は、日常的に製造業者のプロトコールに従って核- ID緑/青の細胞の生存率の試薬を用いて評価されます。さらに、細胞質ゾルのCa 2の変化の統計的分析は、+濃度は必須です。したがって、実験では細胞の4つの別のバッチのために実施されなければならないし、少なくとも20細胞を二つカバースリップは、一回の実験の条件ごとに分析する必要があります。我々は、様々な実験はカバースリップ上で播種後、同時に実行しなければならないことに注意してください。
The authors have nothing to disclose.
SLは、DFG(大学院研究科845)から奨学金によって支えられている。この作品は、DFG(SFB 530/C1&967用)からの補助金によってとHOMFORによってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 |
OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 |
FBS | Biochrom | S0115 |
Penicillin/ Streptomycin | PAA | P11-010 |
HiPerFect | Qiagen | 301707 |
Fugene HD | Roche Diagnostics | 04709713 |
Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 |
FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 |
Puromycin | Sigma | P 7255 |
Thapsigargin | Invitrogen | T-7459 |
Ophiobolin A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 |
Trifluoperazine | Sigma | T 6062 |
Countess® Automated Cell Counter | Invitrogen | |
Typhoon-Trio imaging system | GE Healthcare | |
TE2000-S microscope with DS-5Mc camera | Nikon | |
iMIC microscope with polychrome V | Till Photonics |