Summary
Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.
Abstract
In zoogdiercellen, het endoplasmatisch reticulum (ER) speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese als in calcium signalering 1. De heterotrimere Sec61 complex in het ER membraan biedt een waterige pad voor nieuw-gesynthetiseerde Polypeptiden in het lumen van het ER. Recent werk van verschillende laboratoria gesuggereerd dat dit heterotrimere complex kan ook van voorbijgaande aard Ca 2 + lekkage kanalen 2-8 te vormen. De belangrijkste waarneming voor dit idee was dat het vrijkomen van ontluikende Polypeptiden van het ribosoom en Sec61 complex door puromycine leidt tot een tijdelijke vrijstelling van Ca 2 + uit het ER. Bovendien was het in vitro waargenomen dat de ER luminale proteïne BiP is betrokken bij het voorkomen van ion permeabiliteit op het niveau van de Sec61 complex 9,10. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om direct op de rol van de Sec61 complex als potentiële Ca 2 + lekken kanaal en te karakteriseren zijn vermeende regulerende mechanismen 11-13. Dit systeem combineert siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca 2 + 13. Cellen worden behandeld met siRNA's die gericht zijn tegen de codering en onvertaalde gebied (UTR), respectievelijk van de SEC61A1 gen of een negatieve controle siRNA. In aanvulling analyse worden de cellen co-getransfecteerd met een IRES-GFP vector die de siRNA-resistente expressie van het wild-type SEC61A1 gen maakt. Dan is de cellen worden geladen met de ratiometrische Ca 2 +-indicator Fura-2 om gelijktijdig veranderingen in de cytosolische Ca 2 + concentratie in een aantal cellen door middel van een fluorescentie microscoop monitor. De continue meting van cytosolische Ca 2 + maakt het ook mogelijk de evaluatie van de impact van verschillende middelen, zoals puromycine, kleine molecule inhibitoren, en thapsigargin op Ca 2 + lekkage. Deze experimentele systeem geeft ons de unieke mogelijkheid om i) evaluatie van de bijdrage van verschillende ER membraaneiwitten om passieve Ca 2 + efflux van de ER in verschillende celtypes, ii) het karakteriseren van de eiwitten en mechanismen die deze passieve Ca 2 + efflux te beperken, en iii) onderzoek naar de effecten van de ziekte gelinkt mutaties in de relevante componenten.
Protocol
1. Bereiding van de stam oplossingen
- Bereid calcium-vrije buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM glucose in 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)).
- Solubiliseren Fura-2 AM in DMSO tot een een mM voorraad oplossing te verkrijgen. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing homogeen licht geel. Bescherm beker tegen licht. Verdun de Fura-2 AM voorraad oplossing in 1 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine tot een uiteindelijke concentratie van 4 uM voor het laden van HeLa-cellen.
- Bereid een 12,5 mM puromycine voorraad-oplossing in gedestilleerd water (pH 7,0). Bewaar fracties bij -20 ° C. Verdun de 12,5 mM puromycine voorraad oplossing in de calcium-vrije buffer tot een eindconcentratie van 500 uM puromycine.
- Los thapsigargin in DMSO tot een een mM Stock oplossing te verkrijgen.
- Solubiliseren 1 mg ophiobolin A in 20 pi chloroform en vervolgens mengen met 25 ul DMSO. De microcentrifugebuis blijft open tot chloroform is verdampt. Dus de uiteindelijke ophiobolin Een concentratie is 100 mm. Bewaar fracties bij -20 ° C. Voor gebruik verdunnen voorraad oplossingen in calcium-vrije buffer tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM. Zo doet uiteindelijke DMSO concentratie voor live-cell imaging niet meer dan 0,1%.
- Los trifluoperazine in DMSO tot een concentratie van 10 mM en op te slaan porties bij -20 ° C. Verdun de voorraad oplossingen in calcium-vrije buffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM voorafgaand aan gebruik. Zo uiteindelijke DMSO concentratie voor live-cell imaging, zoals voor ophiobolin A, niet meer dan 0,1%.
- Los van de siRNA's (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA en controle siRNA) in RNase vrij water tot een 20 uM voorraad oplossing voor te bereiden. Meng met behulp van een vortex en observeer oplosbaar met het blote oog. Store 50 ul fracties bij -20 ° C.
2. Gene silencing in HeLa cellen
Met het oog op onderzoek naar de bijdrage van een bepaald eiwit aan ER Ca 2 + efflux, de respectieve-gen op een efficiënte wijze tot zwijgen worden gebracht met twee verschillende siRNA's (afb. 1). Daarnaast is het effect van zwijgen moet worden overwonnen door expressie van de respectievelijke wild type gen. Normaal gesproken gebruiken we siRNA's die gericht zijn tegen de codering en de niet-coderende (UTR) regio, respectievelijk van het gen van belang. Gebruikmakend van UTR-gericht siRNA is een handige manier voor complementatie.
- Zaad 5,2 x 10 5 HeLa-cellen (ATCC Nr. CCL-2) in een 6 cm cultuur schotel met een 25 mm dekglas (vooraf behandeld met 200 ul van poly-L-lysine (1 mg / ml) gedurende 1 uur) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde omgeving met 5% CO 2 (uiteindelijke volume 3,9 ml).
- Transfecteren de cellen met SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA, of een negatieve controle met behulp van siRNA HiPerFect Reagens volgens de instructies van de fabrikant (uiteindelijke concentratie van siRNA: 20 nM). In het kort, vers bereiden siRNA's in een aparte microcentrifugebuis voorafgaand aan de feitelijke transfectie procedure: Voeg 20 pl HiPerFect transfectiereagens tot 4 ui van elk siRNA (20 pM), dat wordt opgelost in 80 pl OptiMEM. Deze mix is voorzichtig gevortext en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg de siRNA mix (104 ul) druppelsgewijs aan de gezaaid 5,2 x 10 5 HeLa cellen (3,9 ml).
- Na 24 uur, wijzigt u het medium (3,9 ml) en transfecteren de cellen voor een tweede keer met dezelfde siRNA mix (104 ul).
- Evalueer zwijgen op te leggen door Western blot-analyse. Het moet hoger zijn dan 80%. Was cellen van de celkweek schotel in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en oogsten ze in DMEM. Tellen van de cellen door het gebruik van de gravin Automated Cell Counter. Lyseren van de cellen in cel lysis buffer (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40), aangevuld met een protease-remmer cocktail (3 ug / ml pepstatine A, 3 ng / ml Leupeptin, 3 ug / ml Antipain, 3 ug / ml Chymastatin) en meng met SDS-sample buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercapto-ethanol, 0,01% broomfenolblauw ) tot een uiteindelijke concentratie van 10.000 cellen / ul te verkrijgen. Warmte monsters bij 56 ° C gedurende 15 minuten en vervolgens, voeg wat glas kralen en vortex gedurende 20 min om fragment DNA. Aparte 20 ul van elk monster door een Laemmli-type SDS-PAGE (meestal 15% polyacrylamid voor het scheiden van gel). Overdracht gescheiden eiwitten op een PVDF-membraan door electroblotting ("nat-blot") bij constante 400 mA gedurende 3 uur of 's nachts in transfer buffer (100 mM glycine, 12,5 mM Tris-HCl). Daarna blok met 5% (w / v) magere melkpoeder in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens bloot de blot aan het primaire antilichaam gericht tegen de C-terminus van Sec61α van konijn en een anti-β-actine- antilichaam van de muis. Was de vlek in PBS-TritonX-100 (0,05%) en tWICE in PBS gedurende 5 minuten, respectievelijk. Visualiseer de primaire antilichamen met behulp van ECL Plex geit-anti-konijn IgG-Cy5-of ECL Plex geit-anti-muis IgG-Cy3-conjugaat en de Typhoon-Trio imaging-systeem in combinatie met de Image Quant TL-software 7.0. In het geval van de SEC61A1 gen, is het maximale effect zwijgen typisch gezien 96 uur na de eerste transfectie. Een representatief experiment is weergegeven in Fig. 2.
3. Invulling van HeLa-cellen
Met het oog op het fenotype van SEC61A1 zwijgen te redden, was de SEC61A1 cDNA ingevoegd in de multiple cloning site (MCS) van een pcDNA3-interne ribosomale entry site (IRES)-GFP-vector die het cytomegalovirus (CMV) promotor, de MCS bevatte, het IRES, plus de groene fluoresecent eiwit (GFP) coderende sequentie.
- 48 uur na de eerste siRNA transfectie, wisselen de medium (3,9 ml) voor een tweede keer en transformeren van de cellen met een lege vector-of SEC61A1 expressieplasmide met behulp van Fugene HD volgens protocol van de fabrikant (laatste verhouding van de vector te Fugene HD is 4 microgram vector tot en met 16 ul Fugene HD). In het kort, vers bereiden plasmiden in een aparte microcentrifugebuis voorafgaand aan de transformatie procedure: Voeg 16 pl Fugene HD transformatie reagens tot 4 ug van elk plasmide dat wordt opgelost in 80 pl OptiMEM. Voorzichtig vortex deze mix en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg de plasmide mix (0,1 ml) druppelsgewijs aan de gezaaid 5,2 x 10 5 HeLa cellen (3,9 ml).
- Na 48 uur van plasmide expressie, onder voorbehoud van cultuur gerechten fluorescentie microscopie voorafgaand aan calcium beeldvorming en oogsten. Indien nodig vervang DMEM door PBS voor een betere fluorescentie signalen. Opnemen fluorescentie beelden op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een gekoelde CCD-camera. Transformatie-efficiëntie kan worden bepaald door het aantal cellen weergeven van GFP-fluorescentie door de cellen geteld in de helderveld modus en moet hoger zijn dan 80%. Een typisch resultaat is weergegeven in Fig. 3.
4. Live-cell imaging calcium
- Voorafgaand aan de meting, overdracht van de dekglas bedekt met getransfecteerde HeLa-cellen in een aparte 3,5 cm cultuur schotel. Laad de cellen met 4 uM Fura-2 in 1 ml DMEM AM gedurende 45 min bij 25 ° C in het donker 11,12.
- Fix een 25 mm dekglas in de iMic metalen kamer en tweemaal wassen cellen en incuberen in een calcium-vrije buffer (telkens 300 ul).
- Beginnen met het verzamelen van gegevens over een iMic microscoop met polychrome V door afwisselend spannend bij 340 nm en 380 nm en het meten van de geëmitteerde fluorescentie bij 510 nm (Filter set: beamsplitter, 565 nm; emitter, 605/70 nm). Sample afbeeldingen met 20-50 cellen / frame om de 3 s. Record Fura-2-signalen als de verhoudingen F340/F380, waar de F340 en F380 naar de achtergrond-gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit overeen bij 340 en 380 nm respectievelijk.
- Na 1 min, de behandeling van cellen met puromycine (500 uM) in calcium-vrije buffer of met dezelfde buffer. Als alternatief, te behandelen cellen met een klein molecuul-remmer (zoals 10 uM trifluoperazine of 100 uM ophibolin A) of met de calcium-vrije buffer.
- Na ratiometrische metingen worden uitgevoerd van 2 tot 10 minuten, voeg thapsigargin (1 uM) en doorgaan met de metingen.
- Uiteindelijk, cytoslic [Ca 2 +] wordt geschat op basis van verhouding tussen de metingen door een gevestigde kalibreringsmethode. 2 Analyseer gegevens door Excel 2007 en Origin 6.1.
5. Representatieve resultaten:
Tot nu toe hebben we de vraag of monddood maken van de SEC61A1 gen van invloed op calcium (Ca 2 +) lekkage van de ER (afb. 1). De SEC61A1-gen werd het zwijgen opgelegd door twee verschillende siRNA's in HeLa cellen voor 96 uur. Terwijl zwijgen op te leggen nauwelijks beïnvloed celgroei en levensvatbaarheid, eiwit transport in de ER van semi-gepermeabiliseerde cellen werd bijna volledig geremd. Bovendien werden de SEC61A1 zwijgen cellen ernstig getroffen met betrekking tot de Ca 2 + lekkage van de ER. Het effect van gene silencing werd teruggedraaid door expressie van het gen SEC61A1. Zo Sec61 complexen die aanwezig zijn in het ER membraan van alle cellen met een kern vormen Ca 2 + lekkage kanalen dat kan worden verwacht dat zij een cruciale rol spelen in Ca 2 + homeostase. Echter, de aanwezigheid van grote, met water gevulde poriën met ongecontroleerde ion permeabiliteit, zoals gevormd door Sec61 complexen in het ER membraan, zou ernstig interfereren met de gereguleerde afgifte van Ca 2 + uit het ER lumen in het cytosol, een essentieel mechanisme voor de intracellulaire signalering. We identificeerden een calmodulin (CAM) binding motief in de cytosolische N-terminus van zoogdieren Sec61α die gebonden CaM maar niet Ca 2 +-vrij apocalmodulin met nanomolaire affiniteit en specificiteit volgorde. Op cellulair niveau, twee verschillende CaM antagonisten gestimuleerd Ca
Figuur 1. Stroomschema. Zie tekst voor details.
Figuur 2. Data-analyse voor het zwijgen efficiency. Zwijgen op te leggen werd geëvalueerd door Western-blot analyse met behulp van antilichamen die zijn gericht tegen Sec61α en β-actine (het laden van controle). De primaire antilichamen werden gevisualiseerd met behulp van ECL Plex secundaire antilichamen en fluorescentie beeldvorming.
Figuur 3. Data-analyse voor transfectie-efficiëntie. Beelden werden opgenomen op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een gekoelde CCD-camera. Transformatie-efficiëntie kan worden bepaald door het aantal cellen weergeven van GFP-fluorescentie door de cellen geteld in de helderveld-modus.
Figuur 4. Screen shots van live-cell imaging van calcium HeLa cellen in de aanwezigheid van controle-of SEC61A1-siRNA en de aanwezigheid of afwezigheid van de CAM-antagonist ophiobolin A. HeLa cellen werden behandeld met siRNA gericht tegen SEC61A1 (B) of een negatieve controle siRNA (A) voor 96 uur zoals aangegeven. Deze cellen werden geladen met de calcium-indicator Fura-2 AM en geïncubeerd in een Ca 2 + gratis buffer met 0.5 mM EGTA, dan buffer of ophiobolin A (Ophio A) in buffer werd toegevoegd en de incubatie hervat. Na 10 min, Ca 2 + release werd geïnitieerd door het toepassen van thapsigargin (TG) in de afwezigheid van externe Ca 2 + en de incubatie werd voortgezet. Screen shots van de continue calcium imaging werden genomen op de aangegeven tijden.
Figuur 5. Data-analyse voor live-cell imaging calcium experimenten. (A) Kinetic en kwantitatieve analyse van een serie experimenten zoals weergegeven in Fig. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] werd geschat op basis van metingen door de verhouding tussen een gevestigde calibratie methode 2. Het effect van thapsigargin wordt weergegeven als staafdiagram. (BD) Cellen werden behandeld met controle siRNA of de aangegeven SEC61A1-siRNA gedurende 48 uur en daarna getransformeerd met een vector-controle (C), of SEC61A1 expressie plasmide (C), of mutant SEC61A1 expressie plasmide (D) zoals aangegeven. Na 48 uur werden calcium imaging experimenten uitgevoerd als in fig. 4 en 5A. Statistische analyse van de veranderingen in de cytosolische Ca 2 +-concentratie na de toevoeging van thapsigargin in experimenten zoals gepresenteerd in A worden weergegeven. P-waarden <0,001 werden gedefinieerd als significant door de ongepaarde t-test en worden aangeduid door drie sterretjes (***), ns, niet significant. Het aantal cellen die werden geanalyseerd worden aangegeven. De gemiddelde waarden worden gegeven, error bars geven standaard fouten van de middelen (sem). Wij merken op dat deze voorbeelden zijn overgenomen van ref. 13.
Figuur 6. Deze gegevens blijkt dat de afgifte van ontluikende ketens van het Sec61 complex inderdaad leidt tot calcium vrijlating uit de ER en de vorming van een calcium nanodomain rond de cytosolische monding van de Sec61 complex. Dit calcium is gebonden aan calmodulin en calcium-calmodulin sluit de Sec61 complex. "
Discussion
In zoogdiercellen, het endoplasmatisch reticulum (ER) speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese als in calcium signalering. Hier hebben we beschreven een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om direct het adres van de rol van een potentiële Ca 2 + lekken kanaal en haar vermeende regulerende mechanismen 13 te karakteriseren. Deze experimentele systeem geeft ons de unieke mogelijkheid om i) evaluatie van de bijdrage van verschillende ER membraaneiwitten om passieve Ca 2 + efflux van de ER in verschillende celtypes, ii) het karakteriseren van de eiwitten en mechanismen die deze passieve Ca 2 + efflux te beperken, en iii) onderzoek naar de effecten van de ziekte gelinkt mutaties in de relevante componenten.
We merken op dat alleen levensvatbare cellen moeten worden geanalyseerd en dat de algehele levensvatbaarheid moet hoger zijn dan 80%. Daarom wordt levensvatbaarheid van de cellen regelmatig geëvalueerd in dienst Nucleaire-ID blauw / groen levensvatbaarheid van de cellen reagens volgens protocol van de fabrikant. Bovendien, statistische analyse van de veranderingen in de cytosolische Ca 2 + concentratie is verplicht. Daarom is de experimenten moeten worden uitgevoerd voor vier verschillende batches van cellen en twee dekglaasjes met ten minste 20 cellen moeten worden geanalyseerd voor elke aandoening in een enkel experiment. We merken dat de verschillende experimenten worden uitgevoerd op hetzelfde moment na het zaaien op de cover glijdt.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
SL werd ondersteund door een beurs van de DFG (Graduate Research School 845). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de DFG (530/C1 SFB & VOOR 967) en door HOMFOR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 | |
| OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 | |
| FBS | Biochrom AG | S0115 | |
| Penicillin/ Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| HiPerFect | Qiagen | 301707 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04709713 | |
| Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 | |
| FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P 7255 | |
| Thapsigargin | Invitrogen | T-7459 | |
| Ophiobolin A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 | |
| Trifluoperazine | Sigma-Aldrich | T 6062 | |
| Countess® Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Typhoon-Trio imaging system | GE Healthcare | ||
| TE2000-S microscopewith DS-5Mc camera | Nikon Instruments | ||
| iMIC microscope with polychrome V | Till Photonics |
References
- Clapham, D. E. Calcium signalling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).
- Van Coppenolle, F. Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores. J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).
- Flourakis, M. Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation. FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).
- Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).
- Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry. Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).
- Amer, M. S. Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).
- Tu, H. Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations. Cell. 126, 981-993 (2006).
- Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation. Cell. 92, 747-758 (1998).
- Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).
- Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells. J. Immunol. 174, 119-130 (2005).
- Gross, S. A. TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels. J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).
- Erdmann, F. Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. EMBO J. 30, 17-31 (2011).
