Summary
優先細菌性病原体の同定のための簡単な方法は、遺伝子組み換えレポーターファージを使用することです。その特定の宿主種に固有のこれらのレポーターファージは、、急速に宿主細胞に生物発光信号応答を伝達することが可能です。ここで、我々は、検出のためのレポーターファージの使用について説明します。
Abstract
ペスト菌と炭疽菌は、それぞれ1、ペストや炭疽の原因物質である細菌性病原体カテゴリです。両疾患"の自然発生は、今は比較的まれですが、生物兵器としてこれらの病原体を使用して、テロリスト集団の可能性は本当のです。病気の本質的な伝達性、急速な臨床経過、及び高い死亡率のため、発生を迅速に検出することが重要です。したがって、迅速な検出と診断を提供する方法論は、公衆衛生対策と危機管理の活性化の即時実施を確保するために不可欠です。
組換えレポーターファージは、Yの検出のための迅速かつ特異的なアプローチを提供することがありますペストとB.炭疽菌。疾病管理予防センターは、現在、これらの細菌性病原体2-4の確認同定のために古典的なファージの溶解アッセイを使用してください。これらのアッセイは、自然に彼らの細菌のホストの特定および溶解性であるファージを発生し活用する。特定のファージの存在下で培養細菌の一晩増殖した後、プラーク（細菌の溶解）の形成は、細菌のターゲットの肯定的な識別を提供する。これらのアッセイは堅牢ですが、彼らは3つの欠点に苦しむ：1）彼らは、実験室ベースで、2）彼らが疑われる試料から細菌の分離培養を必要とし、3）彼らは、完了までに24〜36時間かかります。これらの問題に対処するため、組換え"光-タグ"レポーターファージは遺伝的にYのゲノムにビブリオharveyi luxABの遺伝子を統合して設計されたペストとB.炭疽菌の特定のファージ5-8。結果luxABレポーターファージが急速にすることで、特定のターゲットを検出することができた（分以内）と敏感に受容細胞に生物発光表現型を付与する。重要なのは、検出が培ってきたレシピエント細胞にまたはモック感染臨床検体7とどちらが得られた。
デモンストレーションの目的で、ここでは知られているYのファージを介した検出のための方法を説明します。 ペスト菌は CDCペスト診断ファージΦA11226,7（図1）から構成さluxABレポーターファージを用いて分離する。軽微な変更（成長温度やメディアの例：変更）、と同様の方法は、Bの検出に使用されることがあります炭疽菌はB.を使用して隔離炭疽菌のレポーターファージWβ：：luxAB 8。方法は、栽培Yにbiolumescent表現型のファージを介した情報伝達を説明しますその後、マイクロプレートルミノメーターを用いて測定しているペスト菌の細胞。伝統的なファージの溶解アッセイに比べてこの方法の主な利点は、使いやすさ、迅速な結果、そして96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットで同時に複数のサンプルをテストする機能です。
図1。検出の回路図。ファージを試料と混合され、ファージが細胞に感染する、luxABが発現し、細胞のbioluminescesされています。サンプルの処理が不要です。ファージや細胞を混合し、続いて光を測定している。
Protocol
（1）Y.ペストのプレートの接種
- ストリークY.ペスト A1122（BeiResources＃NR15）ストック培養ルリア-ベルターニ（LB）寒天（ミラー）上に。無菌操作を使用し、すべてのYを行うクラスII型バイオセーフティーキャビネット。Y.におけるペストの操作ペスト A1122はバイオセーフティレベル（BSL）2除外選択エージェントの株である。それは、プラスミド75キロバイトのペア低カルシウム応答（LCR）病原性の両方を欠いている、と病原性に必要なPGMの軌跡。 Yを拡大28℃ ペスト ℃の空気インキュベーターを制御する静的な温度で48時間。 Yの成長率ペスト菌は 1.25 H 9の世代時間と遅いです。
（2）Y.ペスト菌の液体培地接種
- 単一のYを転送する滅菌金属接種ループを使用してLBブロス2 mLを含有する滅菌17 × 100mmの培養チューブにペスト菌のコロニー。サイズの均一なコロニーを選択し、他のコロニーを示している、と明らかにプレート上のコロニーの残りの部分から分離されている。軽くボルテックスチューブと28で文化を育てる° C振盪インキュベーター（225 rpm）で約20時間。
（3）Y.ペスト菌の伸長、レポーターファージ加え、そして生物発光検出
- 一晩Yを薄めるペスト菌の培養50mlファルコンチューブに新鮮なLBブロス（例えば、培地の9.5 mLに細胞を500μL）に1:20 ° C（225 rpm）で振とうしながら28で成長する。 0.2の600 nm（A 600）での光学密度（約5時間）に達するまで成長する。生物発光反応を形質導入するファージの能力は、宿主細菌の生存と適応度に相関しているので、活発に増殖する細胞は、検出のために好ましい。それにもかかわらず、検出システムは、成長のサイクル7のすべての段階で採取された細胞との互換性であることが示されている。
- 2パーセントのn -デカナール溶液を調製することにより生物発光反応に必要な基質を生成する。 LBブロスの9.8 mLでのn -デカナール200μLを混合。 5秒間激しくボルテックスプライム2％のn -デカナール溶液2mLを持つマイクロプレートルミノメーターインジェクタ。ルミノメーターはよくして、各プレートにデカナールソリューションの67μLをautoinject直ちに10秒間のサンプルを読み込むようにあらかじめ設定さ
- 3文化のチューブにLBブロス1 mLのアリコートを分注する。各チューブにレポーターファージストック溶液（5 × 10 9プラーク形成単位の株式[PFU] / mL）を20μLを追加し、ファージとメディアだけではサンプルは、ネガティブコントロールとして機能します。 Yの不在でペスト菌の細胞は、レポーターファージの追加により、生物発光反応を引き出すしないでください。
- Y. 1mLのアリコートを分注する6培養管にペスト菌の培養（ステップ3.1から）。文化の3（試験培養）にレポーターファージストックの20μLを追加。残りの3の文化は"単独で細胞のネガティブコントロール（バックグラウンドのautobioluminescence）として機能する。手短にボルテックスで文化をミックスし、各サンプルから収穫200μL（時間0読み取り用）と白色96ウェルマイクロタイタープレートに分注する。 28で、残りの培養液を、Cを（225 rpm）で振盪しながら。
- マイクロプレートルミノメーターを用いて生物発光の時間0サンプルを（相対発光ユニット、RLU）を測定します。
- 10以降の各サンプルの収穫200μL、20、30、40、50、および60分後のレポーターファージのほか、生物発光用の試料を測定する。 Y.場合ペスト菌の細胞が存在し、レポーターファージは、特に、細胞に結合し、そのDNAを注入し、luxABレポーター遺伝子（図1）転写と翻訳するの転写と翻訳機構をホストが使用されます。
- 信号の強さと信号の応答時間が存在する細胞の数に比例します。細胞（10 5〜10 8 CFU / mL）を、対照と比較したRLUの大幅な増加が高濃度で20分以内に明らかにする必要があります。低細胞濃度では、（10 2 -10 4 CFU / mL）を、RLUの著しい増加は40〜60分以内に明らかにする必要があります。
- また、Y.を必要とせずに検出プロセスを迅速化するペスト菌の伸長は、新鮮な成長プレートからコロニーを、レポーターファージを保有するLBブロス200μLのを1.5mlのエッペンドルフチューブに直接（ボルテックス）混合することができる。マイクロタイタープレートのウェルに細胞/ファージ混合液を分注する。 28℃でマイクロタイタープレートをインキュベートし、60分（シングル時のポイントのみ）後の生物発光のためにサンプルをお読みください。
4。代表的な結果：
Yのレポーターファージを介した検出の代表的なタイムコース実験ペスト菌を図2に描かれている。 1の陰性コントロール）ファージ単独で（無細胞）、または2のみ）セル（無ファージ）60分株式会社を通じて約20 RLUの生物発光のベースラインレベルを提供ubation（ベースラインのレベルはルミノメーター固有のもの）。対照的に、テストサンプル（レポーターファージや細胞）のための生物発光の増加は、ファージ添加後15分で明らかである。信号強度は、60分かけて徐々に増やす必要があります。長期期間（80分以上）のためのインキュベーションは、宿主細胞の媒介溶解をファージに起因するピーク信号から減少する信号となります。同様の結果が37のインキュベーションの温度で得られる° Cにもかかわらず、Yの最適温度ペスト菌の成長は28℃で9です。
図2。 Yのファージを介した生物発光検出ペスト 。0の時点で、レポーターファージ、細胞を28℃でインキュベートし、混合し、そして生物発光は（RLU）を経時的にモニターした。 RLUの大幅な増加は、（*学生t -検定、p <0.05）が15分以内に明らかである。
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Discussion
このメソッドは、急速にYを検出するレポーターファージの能力を示していますレポーターファージからペスト菌は、培養Yに生物発光シグナルの応答を伝達することができるファージの添加後20分以内ペスト菌の細胞。レポーターファージはまた、直接Yを検出することができる分離とその後の栽培7の前提条件なしに臨床マトリックスにおけるペスト 、。一般的に完了するための48時間を必要とする標準的なファージの溶解アッセイと比較して、これは大幅に検出する時間が短縮されます。
これまでの研究では、野生型ΦA1122のファージは、ほぼすべての自然なYを溶解できることが実証されているペスト菌の分離株、 および Yのための"特定"です。 ペスト 6,10,11、しかし、いくつかY.偽結核の菌株は20℃6,10,12以上の温度で増殖させた場合ΦA1122敏感であることが示されている。温度に敏感な微分磁化率の理由は不明だが、細胞表面の層/組成の温度依存性の変化におそらく起因する。したがって、レポーターファージの検出システムの潜在的な注意点は、近縁種であるY.から株による偽陽性反応の可能性です。 偽結核 。制限温度（20℃）でレポーターファージアッセイを実行すると、Yを含む可能性のある試料中の偽陽性シグナルを防ぐことができます偽結核 。特定の温度で成長させた単離した培養液を使用する場合はこのように、特異性は厳密にコントロールすることができます。
Yの要約、迅速な検出と診断にペストは 、ペスト以来、正予後、特に肺ペストのために不可欠であり、治療が発症後最初の24時間以内に投与されていない場合は、ほとんど常に致命的です。このメソッドは、培養分離株の確認同定または臨床的に関連の行列内でこれらのニーズを満たす可能性を秘めています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は国立衛生研究所（NIH）の中小企業イノベーション研究プログラム（NIAID、1R43AI082698 - 01）と食糧農業のUSDA国立研究所（NIFA、2009-33610-20028）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
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