'Bioluminescent' Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Summary

Een eenvoudige methode voor de identificatie van de prioritaire bacteriële pathogenen is het gebruik van genetisch gemanipuleerd reporter faag. Deze verslaggever faag, die specifiek zijn voor hun specifieke gastheer soorten, zijn in staat om snel transduceren een lichtgevend signaal naar aanleiding van gastheercellen. Hierin beschrijven we het gebruik van de reporter faag voor de detectie van

Abstract

Yersinia pestis en Bacillus anthracis zijn categorie A bacteriële ziekteverwekkers die de verwekkers van de pest en anthrax, respectievelijk ^1. Hoewel de natuurlijke aanwezigheid van beide ziekten 'is nu relatief zeldzaam, de mogelijkheid van terroristische groeperingen gebruik van deze pathogenen als een biowapen is echt. Vanwege de ziekte die inherent zijn besmettingsgevaar, snelle beloop, en een hoge mortaliteit, is het essentieel dat een uitbraak snel kan worden opgespoord. Daarom methodologieën die een snelle opsporing en diagnose te bieden zijn essentieel voor de onmiddellijke uitvoering van public health maatregelen en de activering van de crisisbeheersing te garanderen.

Recombinant verslaggever faag kunnen voorzien in een snelle en specifieke aanpak voor de detectie van Y. pestis en B. anthracis. De Centers for Disease Control and Prevention op dit moment gebruik maken van de klassieke faag lyse assays voor de bevestigde identificatie van deze bacteriële pathogenen ^2-4. Deze testen profiteren van natuurlijk voorkomende faag, die specifieke en lytische zijn voor hun bacteriële gastheren. Na een nacht groei van de bacterie gekweekt in de aanwezigheid van de specifieke faag, de vorming van plaques (bacteriële lysis) biedt een positieve identificatie van de bacteriële doel. Hoewel deze tests zijn robuust, ze lijden aan drie tekortkomingen: 1) ze zijn laboratorium gebaseerd zijn, 2) ze vereisen bacteriële isolatie en kweek van het verdachte monster, en 3) zij nemen 24 tot 36 uur om te voltooien. Om deze problemen werden recombinant "light-tag" reporter faag genetisch gemanipuleerde door het integreren van de Vibrio harveyi luxAB genen in het genoom van Y. pestis en B. anthracis specifieke faag ^5-8. De resulterende luxAB reporter faag waren in staat om hun specifieke doelgroep te detecteren door snel (binnen een paar minuten) en gevoelig verlenen van een bioluminescente fenotype aan ontvanger cellen. Belangrijk is dat detectie verkregen, hetzij met gekweekte cellen of de ontvanger met een mock-geïnfecteerde klinische monsters ^7.

Ter demonstratie, hier beschrijven we de methode voor de faag-gemedieerde detectie van een bekende Y. pestis isoleren met behulp van een luxAB reporter faag opgebouwd uit de CDC pest diagnostische faag ΦA1122 ^6,7 (figuur 1). Een vergelijkbare methode, met kleine wijzigingen (bv. verandering in de groei temperatuur en media), kan worden gebruikt voor de detectie van B. anthracis isolaten, met behulp van de B. anthracis verslaggever faag Wβ:: luxAB ^8. De methode beschrijft de faag-gemedieerde transductie van een biolumescent fenotype aan gecultiveerde Y. pestis cellen die vervolgens worden gemeten met behulp van een microplaat luminometer. De belangrijkste voordelen van deze methode boven de traditionele faag lysis assays is het gebruiksgemak, de snelle resultaten en de mogelijkheid om gelijktijdig te testen meerdere monsters in een 96-well microtiterplaat-formaat.

Figuur 1. Detectie schema. De faag worden gemengd met het monster, de faag infecteert de cel, luxAB worden uitgedrukt, en de cel bioluminesces. Monster verwerking is niet noodzakelijk, de faag en cellen worden gemengd en vervolgens gemeten voor licht.

Protocol

1. Y. pestis plaat inoculatie

1. Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) voorraad culturen op Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Gebruik steriele techniek en uitvoeren van alle Y. pestis manipulaties in een klasse II, type A bioveiligheid kast. Y. pestis A1122 is een Biosafety Level (BSL) 2 uitgesloten te selecteren middel stam. Het ontbreekt zowel de 75 kb paar low-calcium respons (LCR) virulentie plasmide, en het PGM locus die nodig zijn voor virulentie. Grow Y. pestis bij 28 ° C gedurende 48 h in een statische temperatuur geregelde luchtvering incubator. Het groeitempo van Y. pestis is langzaam met een generatie tijd van 1.25 uur ^9.

2. Y. pestis vloeibare media inoculatie

1. Overdracht een Y. pestis kolonie in een steriele 17 x 100 mm cultuur buisje met 2 ml van LB bouillon met behulp van een steriele metalen inenting lus. Selecteer een kolonie die is uniform in grootte, is een indicatie van de andere kolonies, en is duidelijk gescheiden van de rest van de kolonies op de plaat. Vortex buis kort en cultuur op te groeien 28 ° C gedurende ongeveer 20 uur in een incubator schudden (225 rpm).

3. Y. pestis uitgroei, verslaggever faag Bovendien, en lichtgevende detectie

1. Verdun de 's nachts Y. pestis cultuur 1:20 in de frisse LB bouillon in een 50 ml Falcon buis (bv, 500 pl van cellen in 9,5 ml medium) en groeien bij 28 ° C met schudden (225 rpm). Groeien tot een optische dichtheid bij 600 nm (A ₆₀₀₎ van 0,2 is bereikt (ongeveer 5 uur). Actief groeiende cellen zijn voorkeur voor de detectie, omdat het vermogen van de faag te transduceren een bioluminescente reactie is gecorreleerd aan de levensvatbaarheid en de conditie van de gastheer bacteriën. Toch is het detectiesysteem is aangetoond dat ze compatibel met cellen geoogst in alle fasen van de groeicyclus ^7.
2. Het genereren van de ondergrond nodig is voor de lichtgevende reactie door het opstellen van een 2% n-decanal oplossing. Meng 200 ul van n-decanal met 9,8 ml van LB bouillon. Vortex krachtig gedurende 5 seconden Prime de microplaat luminometer injector met 2 ml van de 2% n-decanal oplossing. Pre-set de luminometer tot 67 pi van de decanal oplossing autoinject aan elke microtiterplaat goed en direct daarna het monster te lezen voor 10 s.
3. Verdeel 1 ml porties van LB bouillon in drie cultuur buizen. Voeg 20 ul van de verslaggever faag stockoplossing (voorraad van 5 x 10 ⁹ plaque-vormende eenheden [PFU] / ml) aan elke buis, de faag en de media alleen samples fungeert als een negatieve controle. Bij het ​​ontbreken van Y. pestis cellen, zou de toevoeging van de verslaggever faag niet lokken een bioluminescente reactie.
4. Verdeel 1 ml porties van de Y. pestis cultuur (van stap 3.1) in zes cultuur buizen. Voeg 20 ul van de verslaggever faag voorraad tot en met 3 van de culturen (test culturen). De resterende drie culturen dienen als een 'cellen alleen' negatieve controle (achtergrond autobioluminescence). Meng culturen door vortexen kort, en de oogst 200 pi van elk monster (voor de tijd 0 gelezen) en afzien in een witte 96-well microtiterplaat. Incubeer de resterende cultuur bij 28 ° C met schudden (225 rpm).
5. Meet de tijd 0 monsters voor bioluminescentie (relatief lichte eenheden, RLU) met behulp van de microplaat luminometer.
6. Oogst 200 pi van elk monster na 10, 20, 30, 40, 50 en 60 min na-reporter faag Daarnaast, en meet het monster voor bioluminescentie. Als Y. pestis-cellen aanwezig zijn, zal de verslaggever faag specifiek binden aan de cel, zijn DNA injecteren en gebruik de gastheren transcriptionele en translationele machines te transcriberen en vertalen van de luxAB reporter genen (figuur 1).
7. De sterkte van het signaal en het signaal responstijd is evenredig aan het aantal cellen aanwezig. Bij hoge concentraties van de cellen (10 ⁵ -10 ⁸ CFU / ml), een aanzienlijke toename van RLU ten opzichte van de controles moet blijken binnen 20 minuten. Bij lagere concentraties cel, (10 ² -10 ⁴ CFU / ml), moet een aanzienlijke toename van RLU zichtbaar zijn binnen 40-60 minuten.
8. Als alternatief voor het opsporen proces te versnellen, zonder de noodzaak voor Y. pestis uitgroei, een kolonie van een vers volwassen plaat kan worden gemengd (en door vortexen) direct in een 1,5 ml Eppendorf buis met 200 pi van LB bouillon herbergen de verslaggever faag. Doseer de cel / faag mengsel in een putje van een microtiterplaat. Incubeer de microtiterplaat bij 28 ° C en lees de steekproef voor bioluminescentie na 60 min (enkel tijdstip only).

4. Representatieve resultaten:

Een vertegenwoordiger tijdsverloop experiment van de reporter faag gemedieerde detectie van Y. pestis is afgebeeld in figuur 2. De negatieve controles van 1) faag alleen (geen cellen), of 2)-cellen alleen (zonder faag) geven baseline niveaus van bioluminescentie van ongeveer 20 RLU in de 60 min incubation (baseline niveaus zijn luminometer specifiek). In tegenstelling tot een verhoging van de bioluminescentie voor de test monsters (verslaggever faag en cellen) wordt duidelijk op 15 minuten na faag toevoeging. De signaalsterkte moet gestaag stijging ten opzichte van 60 minuten. Incubaties voor langere perioden (meer dan 80 min), zal resulteren in een signaal dat zal dalen van de piek signaal te wijten aan gemedieerde lysis van gastheercellen faag. Vergelijkbare resultaten worden verkregen bij incubatie temperaturen van 37 ° C, ook al is de optimale temperatuur voor Y. pestis groei is 28 ° C ^9.

Figuur 2. Faag-gemedieerde bioluminescente detectie van Y. pestis. Op tijdstip 0, verslaggever faag en cellen werden gemengd, geïncubeerd bij 28 ° C, en bioluminescentie (RLU) werd gevolgd in de tijd. Een significante toename in RLU (* Studenten t-test, p <0,05) is duidelijk binnen 15 minuten.

Discussion

Deze methode toont het vermogen van de verslaggever faag om snel te detecteren Y. pestis, omdat de verslaggever faag kan transduceren een lichtgevend signaal reactie op gekweekte Y. pestis cellen binnen 20 minuten na faag toevoeging. De verslaggever faag is ook in staat om direct opsporen van Y. pestis in klinische matrices, zonder de voorwaarde van de isolatie en de daaropvolgende teelt ^7. Vergeleken met de standaard-faag lysis testen die vereisen over het algemeen 48 uur voor de voltooiing, dit vermindert aanzienlijk de tijd om te detecteren.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de wild-type ΦA1122 faag kunnen vrijwel alle natuurlijke Y. lyseren pestis isoleert, en is 'specifieke' voor Y. pestis ^6,10,11, maar sommige Y. pseudotuberculosis stammen is aangetoond dat ΦA1122 gevoelig wanneer ze groeien bij temperaturen boven 20 ° C ^6,10,12. De reden voor de temperatuur-gevoelige differentieel gevoeligheid is onbekend, maar vermoedelijk te wijten aan de temperatuur-afhankelijke veranderingen in het celoppervlak lagen / samenstelling. Dus een potentieel voorbehoud van de verslaggever faag detectie-systeem is de mogelijkheid van een vals-positieve reactie met stammen uit het nauw verwante soorten Y. pseudotuberculosis. Het uitvoeren van de reporter faag-test op het restrictieve temperatuur (20 ° C) wordt voorkomen dat een vals positief signaal in de monsters kan bevatten Y. pseudotuberculosis. Zo kan de specificiteit streng toezicht wordt gehouden bij het gebruik van geïsoleerde culturen gekweekt bij een bepaalde temperatuur.

Kortom, een snelle opsporing en diagnose van Y. pestis is essentieel voor een positieve prognose, omdat de pest, in het bijzonder longpest, is bijna altijd dodelijk als de behandeling niet is toegediend binnen de eerste 24 uur na ontstaan ​​van de symptomen. Deze methode heeft het potentieel om deze behoeften te voldoen voor de bevestigde identificatie van gekweekte isolaten of in klinisch relevante matrices.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Difco LB agar, Miller	VWR international	90003-346
Difco LB broth, Miller	VWR international	90003-350
17 x 100 mm culture tubes	USA Scientific, Inc.	1485-0810
n-Decanal	Sigma-Aldrich	D7384
Veritas microplate luminometer	Turner Biosystems	9100-001
Microlite microtiter 96-well plate	VWR international	62402-984