Summary
وهناك طريقة بسيطة لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية الأولوية لاستخدام وراثيا مراسل فج. هذه بالعاثية المراسل ، والتي هي محددة لأنواع معينة المضيفة ، قادرة على الاستجابة بسرعة transducing bioluminescent إشارة إلى الخلايا المضيفة. هنا ، نحن تصف استخدام فج مراسل للكشف عن
Abstract
يرسينيا بيستيس وعصيات الجمرة الخبيثة هي الفئة أ مسببات الأمراض البكتيرية التي هي العوامل المسببة للمرض الجمرة الخبيثة والطاعون ، على التوالي 1. على الرغم من الطبيعي حدوث الأمراض على حد سواء "هو الآن نادرة نسبيا ، وإمكانية استخدام هذه الجماعات الإرهابية باعتبارها الاسلحة البيولوجية مسببات حقيقية. بسبب سراية المرض المتأصل ، وبطبيعة الحال السريرية السريع ، وارتفاع معدل وفيات الأطفال ، فمن الأهمية بمكان أن يتم الكشف عن تفشي بسرعة. ولذلك المنهجيات التي توفر الكشف السريع والتشخيص ضرورية لضمان التنفيذ الفوري للتدابير الصحة العامة وتفعيل إدارة الأزمات.
قد المؤتلف بالعاثية مراسل توفير نهج محدد وسريع للكشف عن Y. الطاعون وباء. الجمرة الخبيثة ، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها في الوقت الحاضر استخدام تحلل بالعاثية الكلاسيكية فحوصات لتحديد أكدت هذه مسببات الأمراض البكتيرية 2-4. هذه المقايسات الاستفادة من طبيعيا بالعاثية التي هي محددة وlytic لمضيفيهم البكتيرية. بين عشية وضحاها بعد نمو للبكتيريا المزروعة في وجود فج محددة ، وتشكيل لويحات (تحلل الجرثومي) يوفر تحديد هوية الهدف البكتيرية. على الرغم من أن هذه القياسات ليست قوية ، فإنها تعاني من ثلاثة عيوب : 1) أنها تقوم المختبرات ؛ 2) أنها تتطلب العزلة البكتيرية وزراعة عينة من المشتبه بهم ، و 3) أنها تأخذ 24-36 ساعة لإكمال. لمعالجة هذه القضايا ، والمؤتلف وراثيا "للضوء الموسومة" فج المراسل من خلال دمج جينات harveyi الضمة luxAB في جينوم Y. الطاعون وباء. الجمرة الخبيثة بالعاثية محددة 5-8. وكان مراسل luxAB الناتجة بالعاثية قادرة على الكشف عن هدفهم محددة بسرعة (في غضون دقائق) ، ومنح بحساسية النمط الظاهري bioluminescent إلى الخلايا المتلقية. الأهم من ذلك ، تم الحصول عليها إما مع الكشف عن خلايا المزروعة المستلم أو وهمية مع المصابين العينات السريرية 7.
لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن هنا تصف طريقة للكشف بالعاثية بوساطة من المعروف Y. طاعون عزل باستخدام بالعاثية مراسل luxAB شيدت من فج CDC التشخيص الطاعون ΦA1122 6،7 (الشكل 1). ويمكن استخدام طريقة مماثلة ، مع تعديلات طفيفة (مثل التغير في درجة الحرارة ونمو وسائل الإعلام) ، للكشف عن B. الجمرة الخبيثة العزلات باستخدام B. الجمرة الخبيثة Wβ بالعاثية المراسل : luxAB 8. الأسلوب يصف تنبيغ بالعاثية بوساطة من النمط الظاهري biolumescent المزروعة إلى Y. طاعون الخلايا التي يتم قياسها في وقت لاحق باستخدام luminometer microplate. وتشمل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة على المقايسات بالعاثية تحلل التقليدية هو سهولة الاستخدام ، ونتائج سريعة ، والقدرة على اختبار عينات متعددة في وقت واحد في شكل لوحة microtiter 96 - جيدا.
الشكل 1. الكشف التخطيطي ، وبالعاثية تختلط مع العينة ، وتنميط يصيب الخلية ، وأعرب عن luxAB ، وbioluminesces الخلية. تجهيز العينات ليست ضرورية ، وتنميط وخلايا مختلطة وقياسها في وقت لاحق للضوء.
Protocol
1. Y. طاعون وحة التلقيح
- خط Y. طاعون A1122 (BeiResources # NR15) الثقافات الأسهم على لوريا ، Bertani (LB) آغار (ميلر). استخدام تقنية معقمة ، وتأدية جميع Y. طاعون التلاعب في نوع من الدرجة الثانية ومجلس الوزراء. السلامة الأحيائية Y. طاعون A1122 هو مستوى السلامة الأحيائية (BSL) 2 استبعاد عامل تحديد سلالة. انها تفتقر الى كل من الزوج 75 كيلوبايت منخفضة الكالسيوم الاستجابة (LCR) الفوعة البلازميد ، وموضع PGM التي مطلوبة من أجل الفوعة. تنمو Y. طاعون حتى 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في درجة حرارة ثابتة للرقابة الجوية الحاضنة. معدل نمو Y. طاعون بطيئة مع الوقت جيل من 1.25 ح 9.
2. Y. طاعون سائل الإعلام التلقيح
- نقل احد Y. طاعون مستعمرة في العقيمة 17 × 100 ملم تحتوي على أنبوب الثقافة 2 مل من مرق LB باستخدام التلقيح المعدنية المعقمة الحلقة. حدد مستعمرة يكون موحدا في حجمها ، ويدل على مستعمرات أخرى ، ويفصل بوضوح من بقية المستعمرات على طبق من ذهب. دوامة أنبوب لفترة وجيزة وتنمو ثقافة في 28 درجة مئوية لمدة حوالي 20 ساعة في حاضنة تهتز (225 دورة في الدقيقة).
3. Y. ثمرة طاعون ، بالإضافة مراسل فج ، والكشف bioluminescent
- تمييع Y. بين عشية وضحاها طاعون 1:20 الثقافة في مرق LB العذبة في أنبوب 50 مل الصقر (على سبيل المثال ، 500 ميكرولتر من الخلايا في 9.5 مل من المتوسط) ، وتنمو بمعدل 28 درجة مئوية مع الهز (225 دورة في الدقيقة). تنمو حتى في كثافة ضوئية في 600 نانومتر (A 600) بنسبة 0.2 في التوصل (حوالي 5 ساعات). الخلايا بنشاط متزايد هي الأفضل منذ الكشف عن قدرة فج لتنبيغ يرتبط bioluminescent استجابة لاستمرار واللياقة البدنية من البكتيريا المضيف. ومع ذلك ، فقد ثبت أن نظام الكشف لتكون متوافقة مع الخلايا التي تحصد في جميع مراحل دورة نمو يصل إلى 7.
- توليد الركيزة اللازمة للتفاعل bioluminescent بإعداد 2 ٪ ن decanal الحل. مزيج من 200 ميكرولتر ن decanal مع 9.8 مل من مرق LB. دوامة بقوة لمدة 5 ثانية. رئيس لluminometer microplate حاقن مع 2 مل من محلول ن decanal 2 ٪. قبل تعيين luminometer autoinject إلى 67 ميكرولتر من الحل decanal لكل microplate جيدا ثم قرأ على الفور لمدة 10 ثانية. عينة
- 1 الاستغناء aliquots مل من مرق LB في أنابيب الثقافة 3. إضافة 20 ميكرولتر من المخزون حل مراسل بالعاثية (رصيد 5 × 10 وحدات اللوحة تشكيل 9 [PFU] / مل) لكل أنبوب ، وتنميط وسائل الإعلام وحدها عينات بمثابة سيطرة سلبية. في غياب Y. خلايا الطاعون ، يجب اضافة بالعاثية مراسل استثارة رد فعل لا bioluminescent.
- 1 الاستغناء aliquots مل من Y. طاعون ثقافة (من الخطوة 3.1) في أنابيب الثقافة 6. إضافة 20 ميكرولتر لمراسل بالعاثية الأسهم إلى 3 من الثقافات (اختبار الثقافات). ما تبقى من 3 الثقافات بمثابة سيطرة على "الخلايا وحدها" السلبي (autobioluminescence الخلفية). مزيج الثقافات vortexing لفترة وجيزة ، وحصاد 200 ميكرولتر من كل عينة (للمرة 0 قراءة) والاستغناء عن لوحة بيضاء في 96 - microtiter جيدا. احتضان ثقافة المتبقية في 28 مع اهتزاز (225 دورة في الدقيقة) درجة مئوية.
- قياس الوقت 0 عينات لتلألؤ بيولوجي (وحدات خفيفة نسبيا ، RLU) باستخدام luminometer microplate.
- حصاد 200 ميكرولتر من كل عينة بعد 10 ، 20 ، 30 ، 40 ، 50 ، و 60 دقيقة بالإضافة بالعاثية بعد المراسل ، وقياس عينة لتلألؤ بيولوجي. إذا Y. طاعون خلايا موجودة ، فإن بالعاثية مراسل ربط على وجه التحديد إلى الخلية ، وحقن الحمض النووي ، واستخدام آلات يستضيف النسخي ومتعدية لكتابة وترجمة الجينات مراسل luxAB (الشكل 1).
- قوة الإشارة وزمن الاستجابة إشارة يتناسب مع عدد الخلايا الحالية. ينبغي على تركيزات عالية من الخلايا (10 5 8 -10 كفو / مل) ، زيادة كبيرة في RLU بالمقارنة مع الضوابط يكون واضحا في غضون 20 دقيقة. بتركيزات أقل الخلية ، (10 2 -10 4 CFU / مل) ، وينبغي زيادة كبيرة في RLU يكون واضحا في غضون 40-60 دقيقة.
- بدلا من ذلك ، على الإسراع في عملية الكشف من دون الحاجة إلى Y. قد تكون مختلطة طاعون ثمرة ، من مستعمرة لوحة نمت حديثا (عن طريق vortexing) مباشرة في أنبوب 1.5 مل إيبندورف مع 200 ميكرولتر من مرق LB إيواء مراسل فج. الاستغناء عن خليط الخلية / فج في بئر من لوحة microtiter. احتضان لوحة microtiter عند 28 درجة مئوية ، وقراءة عينة لتلألؤ بيولوجي بعد 60 دقيقة (نقطة واحدة فقط الوقت).
4. ممثل النتائج :
دورة الوقت بوساطة ممثل تجربة بالعاثية مراسل كشف Y. ويصور طاعون في الشكل 2. الضوابط السلبية لل1) فج وحده (أي الخلايا) ، أو 2) الخلايا وحده (أي فج) توفير مستويات أساسية من تلألؤ بيولوجي من حوالي 20 RLU المؤتمر الوطني العراقي طوال 60 دقيقةubation (مستويات أساسية محددة luminometer). في المقابل ، زيادة في تلألؤ بيولوجي للعينات الاختبار (فج مراسل والخلايا) هو واضح في 15 دقيقة بعد إضافة فج. ينبغي زيادة قوة إشارة باطراد على مدى 60 دقيقة. حضانات لفترات زمنية طويلة (أكثر من 80 دقيقة) ، سيؤدي في اشارة الى ان الانخفاض سيكون من إشارة الذروة بسبب بالعاثية تحلل بوساطة الخلايا المضيفة. ويتم الحصول على نتائج مماثلة في درجات حرارة الحضانة من 37 درجة مئوية على الرغم من أن درجة الحرارة المثلى لY. طاعون نمو تصل الى 28 درجة مئوية 9.
الشكل 2. بالعاثية بوساطة الكشف bioluminescent من Y. طاعون. وفي الوقت 0 ، كانت مختلطة بالعاثية مراسل والخلايا ، وحضنت في 28 درجة مئوية ، وتلألؤ بيولوجي (RLU) تم رصد أكثر من مرة. زيادة كبيرة في RLU (* الطلاب اختبار t ، ف <0.05) هو واضح في غضون 15 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب يدل على قدرة بالعاثية مراسل لكشف بسرعة Y. يمكن أن الطاعون منذ بالعاثية مراسل تنبيغ استجابة لإشارة bioluminescent Y. مثقف طاعون داخل الخلايا 20 دقيقة بعد إضافة فج. وبالعاثية مراسل هي أيضا قادرة على الكشف عن مباشرة Y. طاعون في مصفوفات السريرية ، دون شرط مسبق من العزلة واللاحقة 7 زراعة. مقارنة المقايسات بالعاثية تحلل القياسية التي تتطلب عادة 48 ساعة لاستكمال ، وهذا يقلل بشكل كبير من الوقت لاكتشافها.
وقد أثبتت دراسات سابقة أن بالعاثية ΦA1122 البرية من نوع يمكن ليز ما يقرب من جميع الطبيعية Y. طاعون العزلات ، و"محددة" لY. طاعون 6،10،11 ، ولكن بعض Y. وقد تبين أن السلالات الكاذبة لتكون عرضة ΦA1122 عندما نمت في درجات الحرارة فوق 20 درجة مئوية 6،10،12. سبب الحساسية الفرق حساسة للحرارة غير معروف ، ولكن نظرا لدرجة الحرارة يفترض التي تعتمد على التغيرات في طبقات سطح الخلية / التكوين. ولذلك ، والتحذير من احتمال الكشف عن نظام مراسل بالعاثية هو احتمال استجابة إيجابية كاذبة مع سلالات من الأنواع Y. وثيقة الصلة الكاذبة. وسوف يؤدون مقايسة بالعاثية مراسل في درجة الحرارة التقييدية (20 درجة مئوية) منع إشارة إيجابية كاذبة في العينات التي قد تحتوي على Y. الكاذبة. وبالتالي ، يمكن أن تكون خاضعة لرقابة صارمة خصوصية عند استخدام ثقافات معزولة نمت عند درجة حرارة معينة.
في الكشف والتشخيص السريع والملخص من Y. طاعون أمر ضروري لتشخيص إيجابية منذ الطاعون ، والطاعون الرئوي خاصة ، هو دائما تقريبا إلى الوفاة إذا لم يتم العلاج داخل إدارة أول 24 ساعة بعد ظهور الأعراض. هذا الأسلوب لديه القدرة على تلبية هذه الاحتياجات لتحديد مؤكدة من داخل عزلة المثقف أو مصفوفات ذات الصلة سريريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث الأعمال الصغيرة الابتكار من المعاهد الوطنية للصحة (NIAID ، 1R43AI082698 - 01) وزارة الزراعة معهد الوطني للأغذية والزراعة (NIFA ، 2009-33610-20028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
