이 보고서는 첨부 presynaptic 부튼스을 유지 가능한 개별 뉴런의 기계적 분리를위한 기술을 보여줍니다. Vibrodissociated 뉴런은 빠른 생산, 뛰어난 약리 제어 및 인접 세포의 영향없이 향상된 공간 클램프의 장점이 있습니다. 이 방법은 시냅스 요소 및 패치 – 클램프 녹화 영상에 사용될 수 있습니다.
중추 신경계에서 뉴런의 기계적 분리는 presynaptic 부튼스 관심의 절연 신경 세포에 연결된 유지되는 장점이 있습니다. 이것은 세포와 세포 postsynaptic 환경을 잘 제어할 수 조건에서 시냅스 전달의 시험을 수 있습니다. vibrodissociation로 알려진 프로 테아제를 사용하지 않고 진동 기반 기술, 기계 절연을위한 가장 인기있는 기법입니다. 작은 공 모양으로 불을 광택 팁과 micropipette은, P1 – P21 설치류에서 만든 뇌 슬라이스에 배치됩니다. micropipette은 슬라이스 표면에 평행하게 진동하고 고립된 뉴런의 해방에서 발생하는 슬라이스의 두께를 통해 저하됩니다. 고립된 뉴런은 vibrodissociation 몇 분 이내에 학습을위한 준비가되어 있습니다. ; 세포외 환경의 뛰어난 관리 인접 세포의 영향에서 무료로, 적합성 electrophysiological 및 이미징 연구에 적합 가능한 상대적으로 성숙한 뉴런의 빠른 생산이 기술을 포함하여 기본의 연결을 문화, 뇌 조각과 효소 고립된 뉴런의 사용을 통해 이점을 가지고 향상된 슬라이스 또는 세포 배양 준비에서 뉴런에 상대적으로 전체 셀 녹음 공간 – 클램프, 신속한 약물 응용 프로그램과 전체 세포 superfusion를 사용하여 잘 제어 약리 실험. 이 준비는 시냅스 생리학, 약리학, 변조 및 소성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 살아있는 세포와 부튼스에 모두 사전과 postsynaptic 요소의 실시간 영상은 vibrodissociated 뉴런을 사용하는 것도 가능합니다. 사전 및 postsynaptic 요소의 분자 성분의 특성은 또한 면역 및 이미징 기반의 접근 방식과 함께 얻을 수 있습니다.
성공 vibrodissociation는 조각 건강한 뉴런을 포함하고 중간 공백 신경 독성 손상없이 슬라이스를 종료하도록 충분히 유연해야합니다. 건강 조각이 성인 뇌 조각에서 발견보다 glial / interstiatial 재료로 만든 수있을 때 따라서, 기술은 초기 출생 후의 나이 (P1 – 21)에서 최적의 작동합니다. 우리의 경험에서는, 그러나, 자체 vibrodissociation 기술에 대한 역효과 수있는 통에의 연결을 생존을위한 슬라이스 준비를 최적화. 우리는 일상적으로 자당이 vibrodissociation 준비 + 조각이 우리의 일반적인 레코딩 aCSF에서 (예 : 절단) 준비를 수있는 세포 나 + 및 CA 2 정도에 대한 대체되어있는 차가운 수정 aCSF를 사용하여 현장 기록에 대한 조각 준비 반면. 조각 자체의 개별 뉴런에서 녹음 조각을 비교할 때 우리는 또한 ° C 단지 sectioning 후 35 정상 aCSF의 조각을 배치하고 실내 온도로 돌아가기 전에이 온도에서 30-60 분을 두십시오. 그러나, vibrodissociation 준비 조각 그냥 깔끔히 후 상온 즉시 이동됩니다. 이러한 절차는 뉴런이 더 쉽게 슬라이스 자체에서 느슨한 떨면서 수 있습니다 회사 중간 조직의 부족으로 인해 아마도 vibrodissociation 후 건강한 뉴런의 높은 수율을 제공합니다. 우리가 일상적으로 하루에 대한 기록 및 이미징 실험에 충분한 신경을 얻기로 우리는 철저하게, 슬라이스 준비 조건을 검사하지 않았습니다. 이러한 슬라이스 두께 또는 preincubaton 절차의 변경과 같은 추가적인 수정이, 건강한 뉴런의 수율을 높이기 위해 만들 수 있다고 수도 있습니다. 매우 가벼운 테아제 치료는 세포 수율을 향상시키고 기존의 동물에서 작업하는 기술을하기 위해 노력하고 있습니다. 그러나, 결국에 더 약한 테아제 치료 버렸네 기능을 방해하는 것 같습니다. 따라서, 동시에 프로 테아제 및 기계적 분리는 여전히 최신 forebrain의 뉴런에서 신뢰성이 입증되지 않은 작업 찾을 수의 조합.
vibrodissociation이 기술이 풍부한 subtypes의 연결을 주로 프로젝션 뉴런을 공부 주로 유용있다는 것을 의미합니다 이후 이것은 건강한 뉴런의 상대적으로 낮은 수확량에도 주목한다. 의 가용성 GFP – 표현 소형의 연결 subpopulations 쉽게 확인할 수있는 생쥐 것은 이러한 rarer의 뉴런을 공부의 기회를 증가시킵니다. 의 연결 수율을 향상시킬 수 없으면 그러나, 실질적으로 이러한 뉴런의 데이터 축적은 상대적으로 느린 될 가능성이 높습니다.
몇몇 단계는 칼슘 감지 염료와 뉴런의 성공 로딩에 중요한 것으로 입증했습니다. AM – esterified 염색에 노출이 37 ° C에서 수행하고, 우리는 낮은 온도에서 염료로드하려고에 실패했습니다. 염료의 농도는 염료 로딩의 높은 농도가 presynaptic 부튼스의 칼슘 농도를 감소 나타나는 때문에 로딩 시간과 온도 모두를 고려하여 최적화되어야합니다. 우리는 높은 농도로 로딩하면 빈도와 sIPSCs의 진폭을 감소 것을 관찰했습니다. 로드할 때 칼슘을 감지 vibrodissociated 뉴런의 presynaptic 터미널에 염료를주의 작은 presynaptic 부튼스의 용량을 버퍼링하는 것은 소마에서 다를 수 있기 때문에 촬영 및 부튼스의 크기가 일치하지해야합니다. 신경 세포 함유 요리는 염료로드 다음 HEPES 버퍼 외부 솔루션과 함께 세탁하고, 세탁 후 회복 시간이 매우 중요합니다입니다. 또한, 전체 세포 기록을위한 좋은 도장을 만들어, 세포는 외부 세포 멤브레인 이외의 internalized 염료 분자 없애 깨끗이 씻어해야합니다.
전기 생리학 및 라이브 셀 이미징에 대한 vibrodissociated 뉴런을 사용하는 것 외에도, immunocytochemical 기술은 이러한 세포 11,12에도 적용할 수 있습니다. 전지는 쉽게 고정 및 항체의 다양한, 그리고 다른 세포 마커 물들일 수 있습니다. 이러한 세포의 사용은 GABAergic presynaptic 터미널에서 단백질 표현의 시각화를위한 깨끗한 준비를 제공합니다. GABAergic 뉴런 특정 발기인의 통제하에 형광 단백질을 표현하는 마우스를 사용하면 조사가 vibrodissociated 준비의 개별 시냅스 터미널 (그림 1)을 식별할 수 있습니다. 이 유형의 이미징 형광 표식이 레이저 기반의 현미경과 같은 최신 기술 STED (자극 방출 고갈 현미경)을 사용하여 터미널에서 형태학의 측정에 허용할 수 있습니다. 시냅스 소포의 자전거를보고 염료와 시각화이 준비도 가능합니다. 아카 이케와 동료는 살아있는 세포 4 터미널을 시각화하기 위해 styryl 염료, FM1 – 43와 GABAergic 터미널을 분류했습니다.
또한 vibrodissociated의 프로필 RNA 표현에 단일 셀 리버스 transcriptase PCR을 수행할 수 있어야한다뉴런. 이 기술은 정기적으로 세포 배양 재배 효소 – dissociated 뉴런과 뉴런에 적용됩니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 DRS을 인정하고 싶습니다. 초기 중에 도움 핑 Jun Zhu와 스스무 고야마은 기술의 설정 및 서면 논문 서식에 도움 박사 베로니카 알바 레즈. 이 연구는 NIAAA의 교내 임상 및 바이오 메디컬 연구의 부문으로 자금을했습니다.
Item | Company | Catalog# | Comments |
Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems Inc. | VT1200S | |
Cell Culture Dish (35 mm) | BD Falcon | 353001 | |
Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
Piezoelectric Manipulator | Exfo-Burleigh | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piezoelectric manipulator |
Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon | TS200 Diaphot | |
EMCCD Camera | ANDOR Technology | iXonEM+ DU-888 | |
Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO Photonics Solutions Inc. | X-Cite 120PC | |
Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes | F14201 |