Summary
Этот отчет демонстрирует технику для механической изоляции отдельных жизнеспособных нейронов сохраняя прилагается пресинаптических boutons. Vibrodissociated нейроны имеют преимущества быстрого производства, отличное фармакологического контроля и улучшения пространства-зажим без влияния из соседней клетки. Этот метод может быть использован для работы с изображениями синаптических элементов и патч-зажим записи.
Abstract
Механические диссоциации нейроны от центральной нервной системы имеет то преимущество, что пресинаптические boutons остаются прикрепленными к изолированного нейрона интересов. Это позволяет для исследования синаптической передачи в условиях, когда вне-и внутриклеточной среды постсинаптических может легко контролироваться. Вибрации основе методики без использования протеаз, известных как vibrodissociation, является наиболее популярной техникой для механической изоляции. Микропипетки, с кончика огневой полировкой к форме небольшого шарика, помещаются в мозге часть из P1-P21 грызунов. Микропипетки вибрирует параллельно поверхности среза и опустил через толщина среза в результате освобождения изолированных нейронов. Изолированных нейронов готовы для обучения в течение нескольких минут vibrodissociation. Этот метод имеет преимущества перед использованием первичных нейронов культур, мозг ломтиками и ферментативно изолированных нейронов в том числе: быстрое производство эффективных, относительно зрелых нейронов подходит для электрофизиологических исследований и обработки изображений; превосходный контроль внеклеточной среде, свободной от влияния соседних клеток; пригодность для хорошо контролируемых фармакологических экспериментов с использованием быстрое применение наркотиков и общего superfusion клетки; и улучшения пространства-зажим в цельноклеточной записи по отношению к нейронам ломтик или препаратов клеточной культуры. Этот препарат может быть использован для изучения синаптической физиологии, фармакологии, модуляции и пластичности. В режиме реального времени изображений как до, так и постсинаптические элементы в живых клетках и boutons Также возможно использование vibrodissociated нейронов. Характеристика молекулярной составляющих до-и постсинаптические элементы также могут быть достигнуты с иммунологическими и обработки изображений подходов.
Protocol
1. Подготовка стеклянные запаянные микропипетки
- Использование микроэлектрода стекло, вытащить стандартный патч-зажим микропипетки на Flaming-Браун или эквивалент микропипетки съемник (наконечник диаметром ~ 2 мкм). Место микропипетки наконечник в пламени горелки Бунзена в течение ~ 2 сек до плавленого формы шар с диаметром 200-300 мкм.
- Место запаянные пипетки патча на держателе микроманипулятора, которые могут быть быстро вибрировать из стороны в сторону (проезд расстоянии 100-200 мкм) с помощью пьезоэлектрического биморфного, реле, или, что эквивалентно эффективной устройства.
2. Подготовка фрагментов мозга от P1-P21 Крысы или Мыши
- Подготовка искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF) в следующем составе (в мм): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, и 10 D-глюкозы. Bubble решение с 95% кислорода / 5% СО 2 в течение ~ 15 мин, затем добавить 2 мМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2.
- Резка мозга ломтиками:
- Обезболить животное с галотан или изофлуран. Обезглавьте животного - удалить мозга - блок мозга в желаемой ориентации (короны, парасагиттальных, поперечные и т. д.), включив в регионах, представляющих интерес.
- Прикрепите заблокирован мозга этапе вибрирующий мозг слайсер погружен в aCSF - раздел мозга на 250-400 мкм, толщина - место ломтики в aCSF пузырилась с карбогена в "предварительной инкубации" камеры на сетку, которая позволяет жидкости / газа воздействия на любых поверхностях - позволяют ломтиками, чтобы уравновесить в этой среде, по крайней мере один час.
3. Vibrodissociation
- Заполнить 35 мм в диаметре культуры блюдо с HEPES-солевой буфер решение следующего состава (мМ): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 2 MgCl, CaCl 2,5 2, 10 D-глюкозы с рН установлен в 7,4 использованием NaOH и осмолярность доводят до ~ 300 мОсм использованием сахарозы. Культура блюда могут быть подвески посуды, стандартных блюд клеточной культуры, культуры блюда со вставками стекла покровного, или блюда покрыта, например, поли-L-лизин, в зависимости от необходимости укрепления ячейки соблюдение блюдо дно.
- Место среза в культуре блюдо и визуализации с рассекает стереоскоп при 250 х Держите ломтик на дно использованием изогнутых платиновой проволоки (0,5 мм в диаметре), расположенных на верхней поверхности среза выступать в качестве веса.
- Поместите кончик запаянные микропипетки на срез поверхности в нужном отделе мозга. Активировать микроманипулятора вибрировать кончиком латерально на 10-30 Гц, с экскурсией расстоянии ~ 100 мкм. Использование микроманипулятора, перемещать кончиком глубже в срез ткани такова, что она проходит через весь срез в течение ~ 30 сек. Повторите этот шаг, сколько необходимо для максимального числа изолированных нейронов получить из данной области мозга.
- Удалите наконечник от среза - забрать часть щипцами и осторожно встряхните его в то же время в растворе - удалите часть полностью и выбросьте.
- Разрешить диссоциированных клетки для проведения расчетов и придерживаться блюдо дно, по крайней мере 10 мин.
4. Электрофизиологические Запись
- Место блюдо с нейронами на этапе инвертированного микроскопа и визуализации с 10 х 63 х к цели. Ищите нейронов с гладкой мембраны патент, не blebbing, и обнаружить, но не негабаритных ядра. Если оптики фазового контраста используется, посмотрите по поэтапному яркие нейронов с желтовато-оттенком, не слишком синий. Переливать клетки с внеклеточной раствор, содержащий желаемый солей, питательных веществ, антагонисты рецепторов, и т.д. (наш стандарт HEPES-солевой буфер, упомянутые выше (раздел 3.1)), часто с добавлением 5 мкМ 2,3-диоксо-6-нитро-1, 2,3,4-тетрагидробензо [F] хиноксалин-7-сульфонамид динатрия (NBQX) и 25-100 мкМ D-2-амино-5-phosphonopentanoic кислоты (AP5), чтобы заблокировать ионотропных глутаматных рецепторов, что позволяет для изоляции быстро ГАМК рецептор-опосредованного IPSCs 1,2.
- Вытяните стандартных микропипетки патч используя Flaming-Браун или эквивалент съемника. Пипетки сопротивление должно быть 2-4 МОм (в зависимости от целевого размера ячейки) при заполнении Cl - - на основе решения.
- Создание целой клетки записи с визуализированы с использованием стандартного нейрона электрофизиологических методов.
- Запись спонтанных постсинаптических токов (sPSCs), используя разрыв без сбора данных протокола. Применить 0,2-1 тетродотоксин мкМ и / или низкой Ca 2 + - содержащие внеклеточной решение для записи миниатюрные постсинаптические токи (mPSCs).
- Решения и фармакологические препараты могут быть непосредственно применены к клеткам. Мы используем местные superfusion из плавленого квадратных наконечником стеклянные трубки с раствором обмена с участием боковое движение трубы монтируются на шагового двигателя микроманипулятора. Это аллобыл для решения обмена в 10-ым к 100s из мс для достижения быстрых изменений во внеклеточной молекулярной содержание, применение агонистов рецепторов, и т.д.
- Акаике и его коллеги разработали методы, чтобы стимулировать одного пресинаптического boutons 3,4. Микропипетки находится возле визуализированы Bouton и стимулирования дается (отрицательные токи стимулом 5-10 мкА, 0,1-0,2 мс). Унитарное IPSCs регистрируются, и такие методы, как метод сбои могут быть использованы для изучения изменений в пресинаптических и постсинаптических функции.
5. Изображений пресинаптических окончаний
- Постсинаптические нейроны могут быть заполнены различными красителями с помощью патча пипетки. Нейроны могут также быть сделаны из мышей, экспрессирующих флуоресцентных белков (ФП), такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) в отдельных клеточных популяций.
- Пресинаптические терминалы могут быть визуализированы на vibrodissociated нейронов из мышей, которые выражают ФП, в частности, население интернейронов. Например, мышей, экспрессирующих GFP обусловлен глутамат декарбоксилазы 65 (GAD65) промоутер шоу зеленый somata и процессы в клетках гиппокампа корзины и других интернейронов. Vibrodissociated пирамидных нейронов гиппокампа от региона CA1 у GFP-положительных аксонов терминалов соединенный с их somata и проксимальных дендритов (рис. 1А). Пирамидных нейронов vibrodissociated от мышей, которые выражают synaptopHlourin (рН-чувствительных мутантов GFP, слитый с синаптических пузырьков связанных VAMP2 белка) под контролем промотора Thy1 также FP-положительных прилагается boutons, которые показывают, рН-чувствительных флуоресценции (рис. 1В).
- Пресинаптических boutons могут быть загружены с кальцием индикатор красителей и других флуоресцентных молекул с помощью АМ-соединения сложных эфиров 5. На рисунке 2 показан пример загрузки использованием кальций-индикатор красителя Fluo4-AM. Во-первых, 1-2 мкМ AM-этерифицированные краситель наносится на нейроны при 37 ° в течение 10 мин. Краска может проникать во внутриклеточное среде, где эстераз расщеплять молекулы, что дает свободный, клеточно-impermeant и незамороженных красителя. Такой подход нагрузки как до, так и постсинаптические клеточных элементов. После загрузки, клетки промывают HEPES-солевой буфер решения и хранятся при температуре 37 ° С в течение дополнительных 10 минут. До принятия ГОм-печать с электродом пипетка стекло, клетки промывают 3 раза с внешними буферный раствор.
- Цельноклеточная запись затем устанавливается с помощью красителя свободного внутриклеточного раствора. После 2-5 минут записи, краситель в основном удален из постсинаптического нейрона, что позволяет визуализировать Fluo-4-загружалась синаптических boutons. Этот метод был впервые Е. и др. 5.
- Красителя загружены boutons могут быть визуализированы использовании большого увеличения, высокие численные цели диафрагмы или с камеры основе или многофотонной микроскопии. Одновременное цельноклеточная записи и кальция изображений можно достичь с помощью установки, как показано на рисунке 3. Образы нейрона и boutons показано на рисунке 2C были захвачены с электронным устройством умножения с зарядовой связью (EMCCD) камеры. Мощность источника света для возбуждения ослабленного до 1,2% с 1,0 нейтральной плотности фильтра и фильтра диафрагмой доводят до 12% мощности. Кальций переходных от зеленого пресинаптических boutons можно наблюдать и записать в реальном времени, и измеряется в автономном режиме.
6. Представитель Результаты:
Спонтанное и текущие Injection-Вызванные Обжиг Vibrodissociated Нейроны
Записи из типичных vibrodissociated гиппокампа СА1 пирамидальный нейрон показаны на рисунке 4A. Спонтанные потенциалы действия превышения можно наблюдать в пирамидных нейронов отделена от крыс базолатеральной миндалине, гиппокампе и VTA 1,5. Во время ток-зажим записи с СА1 пирамидных нейронов, гиперполяризующих инжекции тока производит типичные ответы напряжения при деполяризующего тока достаточной величины, вызывает превышение потенциалов действия с задержкой типичный образец стрельбы с умеренным текущих уровней и не-размещения потенциалов действия в ответ на сильный ток инжекции ( Рис 4В).
Спонтанное и миниатюрные постсинаптические ГАМК Ингибирующее токи в Vibrodissociated Нейроны
Во время напряжения-зажим записей с CsCl основе внутриклеточного решения, спонтанные синаптические токи наблюдаются (рис. 5А). Эти события будут устранены в низкое содержание кальция в раствор, содержащий 2,6, и в большинстве нейронов типа полностью блокирован ГАМК рецепторов, таких как бикукуллином или gabazine (рис. 5б, в), указывая, что это sIPSCs опосредованы ГАМК выпуска и активации этого подтипа рецепторов ионотропных. Тем не менее, в принципе, нейроны мозга от таких регионах, как базолатеральной миндалины 2 и вентральной области покрышки 5,7, ГАМК рецепторы блокадапоказывает меньшую продолжительность EPSCs посредничестве глутаматергической активацией АМРА-типа рецепторов. Интересно, что применение ТТХ при концентрациях, которые являются специфическими для блокады наиболее чувствительных к токсин напряжения закрытого натриевые каналы снижает частоту и амплитуду sIPSCs наблюдается в vibrodissociated нейронов от нескольких областях мозга (рис. 6А) 2,4,7. Таким образом, активность натриевых каналов участвует в ГАМК-релиз, в ущипнул-офф синаптических boutons. Пока еще не ясно, если полномасштабный потенциалов натрия действия происходят в этих терминалах. Стоит отметить, что входное сопротивление хорошо запечатаны 1 мкМ окончание аксона диаметра, вероятно, будет хорошо в ГОм диапазона. Таким образом, открытие даже небольшого количества натриевых каналов может быть недостаточно для деполяризовать терминалы для активации кальциевых каналов, которые опосредуют связи возбуждения секреции. По поводу этих кальциевые каналы, данные свидетельствуют о том, что N и P / Q-образные каналы участвовать в выпуске на ГАМК-терминалов в vibrodissociated препаратов из гиппокампа СА1 и в других местах 8.
Модуляции и пластичности передачи ряда нейромедиаторов и рецепторов был рассмотрен использованием vibrodissociated нейронов 3,4,9. Нейротрансмиттеров показано, что такие действия являются модуляторных аденозин, ГАМК, серотонин, эндоканнабиноиды и т.д. 2,6,10,11,12. Кроме того, краткосрочные синаптической пластичности, таких как эндоканнабиноидов-зависимой деполяризации вызванного подавлением торможения (DSI) также был описан в этой подготовке 2,11. Эти результаты показывают, что многие формы рецептор-опосредованного и транс-синаптических сигнализации эндогенными нейромодуляторов целы в vibrodissociated подготовки.
Кальций Переходные и везикулярного выпуска в Axon терминалов в Vibrodissociated подготовка
Использование EMCCD оборудованных инвертированного микроскопа описано выше, мы рассмотрели кальция переходных процессов в пресинаптические терминалы в vibrodissociated нейрон-Bouton подготовки. На рисунке 2 показана ячейка нагрузки с АМ-этерифицированные Fluo-4 и последующего разведения постсинаптических красителя в гиппокампа СА1 пирамидальных нейронов. Спонтанное переходных кальция наблюдаются в некоторых красителей заполненные boutons показано, как регионы, представляющие интерес (трансформирования) на рис 6В. Применение 1 мкМ тетродотоксин (TTX) устраняет эти спонтанные переходных процессов, указывая, что они опосредованы активацией напряжения натриевых токов, которые спонтанно активизируется в boutons, что приводит к последующим поднимается кальция. Увеличение внеклеточной KCl от 10 мм до 40 мм с быстрым решением производит обмен увеличился флуоресценции, измеряемой в трансформирования, которые соответствуют пресинаптических окончаний (рис. 7а). Одновременная запись из постсинаптического нейрона используется для мониторинга sIPSCs и определить, если событие частоты увеличивается на высоком K + деполяризации (рис. 7б).
Для визуализации пузырьков синтеза в пресинаптических boutons мы использовали мышей, экспрессирующих synaptopHlourin построить под контролем Thy1 промотора (помечены spH21 мышей). SynaptopHluorin в молекулярной построить в котором эклиптики pHlourin (GFP мутанта с повышенной чувствительностью рН) 12 связан с пузырьком связанные мембранный белок (VAMP2) 13. Этот механизм помещает pHlourin мотив в просвете пузыря, где сравнительно кислая среда гасит флуоресценцию. После слияния пузырьков этот мотив подвергается более нейтральный внеклеточной среде с результирующее увеличение флуоресценции при puncta, которые соответствуют пузырьки / пресинаптических окончаний. Vibrodissociation нейронов гиппокампа от spH21 мышей позволяет визуализации флуоресцентных puncta от размера и расположения ожидается ГАМКергических терминалов (рис. 8А). Применение высоких K + - содержащие внешнее решение увеличивает флуоресценции в этих терминалов, и этот эффект блокируется в присутствии внешнего раствора, в котором внеклеточного кальция снижается до 0,2 мм (рис. 8Б). Таким образом, деполяризация вызванного увеличением флуоресценции-видимому, отражает возбуждения секреции связи на ГАМК-синапсы в нейрон-Bouton подготовки.
Способности измерять пресинаптических переходных кальция и пузырьков синтеза в аксон терминалы нейрон-Bouton препарата позволяет нам изучить последствия нейромодуляторов, наркотиков и синаптической пластичности на пресинаптические механизмы, участвующие в возбуждения секреции связи и экзоцитоза / эндоцитоза. Эти методы могут быть объединены с другими молекулярными инструментами и генной инженерии мышей для изучения роли белков в частности пресинаптических функции и модуляции / пластичность.
Рисунок 1. Vibrodissociated нейроны из гиппокампа области СА1 () Объединенные образ DICм зеленых флуоресцентных изображений из GAD65 мыши. DIC изображение сливается четко показать расположение зеленых терминалов (B) флуоресценции изображение из synaptophluorin (spH21) мыши. Шкала бар = 10 мкм
Рисунок 2 Кальций индикатор загрузки процедура: (А) всю камеру загружается с АМ-этерифицированные красителя; (B) цельноклеточная записи разбавляет краситель; (C) терминалов визуализируются как области интереса (наконечники стрел)..
Рисунок 3. Схема экспериментальной установки для одновременной цельноклеточная записи изображений и кальция в пресинаптические терминалы на vibrodissociated нейронов. EMCCD = электронного умножения Прибор с зарядовой связью.
Рисунок 4. Представителю сигналы отображаются () спонтанные потенциалы действия от vibrodissociated CA1 нейронов и (Б) ответы мембранные напряжения гиперполяризующих и деполяризующего тока инъекций в текущем зажим записи из нейронов СА1.
Рисунок 5. () Представитель сигналов спонтанного IPSCs от СА1 пирамидальных нейронов. (BC) IPSCs были заблокированы либо gabazine (10 мкМ, B) или бикукуллином (20 мкМ, C).
Рисунок 6. ТТХ ингибирует спонтанное ГАМКергических синаптической передачи, а также исключает пресинаптических переходных кальция в vibrodissociated гиппокампа подготовки. (А) Запись с vibrodissociated нейрона до и во время нанесения ТТХ. Обратите внимание на уменьшение частоты и амплитуды sIPSCs. (B), кальция наблюдается в переходных Fluo-4-загружалась пресинаптических терминала на vibrodissociated нейрона до и во время нанесения ТТХ. Обратите внимание на полную потерю переходных процессов.
Рисунок 7. Одновременная визуализация показатель кальция и sIPSC цельноклеточная записи показывающие влияние высоких K + стимуляции. (А) флуоресценции измеряли с течением времени из пресинаптических Bouton загружены Fluo-4 утра краску. (B) Одновременное увеличение sIPSC частоты и амплитуды во время высокого приложение K +.
Рисунок 8. Ca 2 +-зависимые высокого K + ответ в пресинаптических boutons из spH21 пирамидальных нейронов гиппокампа от региона CA1. (А) Флуоресценция образ vibrodissociated нейрона. (B), High-K +-приложения (показано черными бар) в результате устойчивый рост флуоресценции в присутствии нашего нормального внеклеточного Са 2 +-содержащий раствор (2 мМ Са2 +). Нет флуоресценции увеличение наблюдалось при низких внеклеточного Са 2 + (0.2 мМ Са 2 +). Данные в графе были нормализованы предварительного высокого K + флуоресценции уровнях, и показать средний отклик от 3 boutons.
Discussion
Успешное vibrodissociation требует, чтобы ломтики содержать здоровые нейроны и что интерстициальные пространства являются достаточно гибкими, чтобы позволить нейронам, чтобы выйти срез без токсических повреждений. Таким образом, метод работает оптимально в раннем постнатальном возрасте (P1-21), когда здоровые ломтиками может быть сделан с меньшим глиальных / interstiatial материала, чем содержится в срезах мозга взрослого человека. По нашему опыту, тем не менее, оптимизация часть подготовки к выживанию нейронов в срезе само по себе может оказаться контрпродуктивным для vibrodissociation техники. Принимая во внимание, мы регулярно готовить срезы для записи на месте с использованием холодного изменение aCSF сахарозы, в которой был заменен на протяжении большей части внеклеточного Na + и Са 2 +, ломтики готовы к vibrodissociation могут быть подготовлены (например, вырезать) в нашей обычной aCSF записи. При подготовке ломтиками для записи с отдельными нейронами в ломтиками сами мы также места срезов в нормальном aCSF при 35 ° С только после перерезки и оставить их в течение 30-60 мин при этой температуре перед их возвращением до комнатной температуры. Тем не менее, ломтики готовы к vibrodissociation перемещаются сразу до комнатной температуры сразу после нарезки. Эти процедуры дают более высокий урожай здоровых нейронов после vibrodissociation, возможно, связано с отсутствием четких интерстициальной ткани, что позволяет нейронам быть более легко потряс освободиться от среза себя. Мы не исчерпывающе рассмотрены условия ломтик подготовки, а мы регулярно получать достаточное нейронов для наших записи и обработки изображений эксперименты на данный день. Вполне возможно, что дополнительные изменения, такие как изменение толщины среза или preincubaton процедуры, можно было бы увеличить выход здоровых нейронов. Очень мягкий лечения протеазы были опробованы в целях повышения урожайности и клетка получить технику для работы в старых животных. Тем не менее, неизменно, даже мягкое лечение протеазы, кажется, нарушают синапс функции. Таким образом, в то время как сочетание протеазы и механической диссоциации все еще можно найти работу они не доказали свою надежность в переднем мозге нейронов на сегодняшний день.
Кроме того, следует отметить относительно низкую доходность здоровых нейронов после vibrodissociation означает, что техника в основном полезен для изучения обильные нейронов подтипов, в основном нейроны проекции. Наличие GFP-экспрессирующих мышей, у которых небольшой субпопуляции нейронов могут быть легко идентифицированы увеличивает шанс изучения этих реже нейронов. Однако, если выход нейрона может быть существенно улучшилась накопления данных об этих нейронов, вероятно, будет сравнительно медленным.
Несколько шагов оказались иметь решающее значение для успешной загрузки нейронов кальцием зондирования красителей. Воздействие AM-этерифицированные красителя производится при температуре 37 ° С, и мы не увенчались успехом в попытке красителя нагрузки при низких температурах. Концентрация красителей должны быть оптимизированы с учетом как время загрузки и температуры, поскольку кажется, что более высокая концентрация красителя загрузки снижает концентрацию кальция в пресинаптические boutons. Мы наблюдали, что загрузка с более высокой концентрацией уменьшается частота и амплитуда sIPSCs. При загрузке кальция зондирования красителей в пресинаптических терминалах vibrodissociated нейроны, необходимо соблюдать осторожность, потому буферной способности небольших пресинаптических boutons может быть иной, чем в Сома и размеров boutons не соответствуют. Нейрон-содержащих блюда промывают HEPES буфером внешнее решение следующих красителя нагрузки, а время восстановления после мытья имеет решающее значение. Кроме того, чтобы сделать хорошее уплотнение для цельноклеточной записи, клетки должны быть тщательно промывают, чтобы избавиться от не-внутреннее молекул красителя из внешней клеточной мембраны.
В дополнение к использованию vibrodissociated нейронов для работы с изображениями камера электрофизиологии и жить, иммуноцитохимического методы могут также применяться для этих клеток 11,12. Клетки могут быть легко исправлены и окрашивали различных антител и других маркеров клеток. Использование этих клеток обеспечивает чистый препарат для визуализации экспрессии белка в ГАМКергических пресинаптических окончаний. Использование мышей, которые выражают флуоресцентных белков под контроль промоутеров специфичные для нейронов ГАМКергических позволяет следователю для идентификации отдельных синаптических терминалов в vibrodissociated препарата (рис. 1). Изображений флуоресцентных маркеров этого типа может позволить морфологических измерений в терминалы с использованием лазерной микроскопии и новые методы, как Стед (стимуляция выбросов Истощение микроскопия). Визуализация с красителями, что в докладе синаптических пузырьков езда на велосипеде также возможно с этим препаратом. Акаике и его коллеги назвали ГАМК-терминалы с стирил краситель, FM1-43 для визуализации терминалов в живых клетках 4.
Следует также можно выполнять одноклеточные обратной транскриптазы ПЦР для выражения профиля РНК в vibrodissociatedнейронов. Этот метод обычно применяется к ферментативно-диссоциированных нейронов и нейронов, выращенных в культуре клеток.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра. Ping Минь Чжу и Сусуму Кояма за помощь во время начальной настройки техники, и доктор Вероника Альварес за помощь в форматировании письменного рукописи. Это исследование было профинансировано Отдел клинической Внутренние и биомедицинских исследований NIAAA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Cell Culture Dish (35 mm) | BD Biosciences | 353001 | |
| Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
| Piez–lectric Manipulator | EXFO | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
| SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piez–lectric manipulator |
| Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
| Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
| Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
| Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon Instruments | TS200 Diaphot | |
| EMCCD Camera | Andor | iXonEM+ DU-888 | |
| Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO | X-Cite 120PC | |
| Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes, Life Technologies | F14201 |
References
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).
- Akaike, N., Moorhouse, A. J. Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology. Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).
- Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron. Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).
- Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area. J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).
- Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons. J Physiol. 529, 373-383 (2000).
- Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area. Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).
- Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons. Brain Res. 951, 121-129 (2002).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity. J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).
- Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation. Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).
