इस रिपोर्ट में व्यक्तिगत रूप से व्यवहार्य संलग्न presynaptic BOUTONS बनाए रखने न्यूरॉन्स की यांत्रिक अलगाव के लिए एक तकनीक को दर्शाता है. Vibrodissociated न्यूरॉन्स तेजी से उत्पादन, उत्कृष्ट औषधीय नियंत्रण और पड़ोसी कोशिकाओं से प्रभाव के बिना सुधार अंतरिक्ष दबाना फायदे हैं. इस विधि synaptic तत्वों और पैच दबाना रिकॉर्डिंग की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यांत्रिक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से न्यूरॉन्स की हदबंदी लाभ है कि presynaptic BOUTONS ब्याज की अलग न्यूरॉन से जुड़ी रह गया है. शर्तों जहां कोशिकी और postsynaptic intracellular वातावरण को अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है के तहत synaptic प्रसारण की परीक्षा के लिए अनुमति देता है. Proteases के उपयोग के बिना एक तकनीक कंपन आधारित है, vibrodissociation के रूप में जाना जाता है, यांत्रिक अलगाव के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक है. एक छोटी सी गेंद के आकार आग पॉलिश टिप के साथ एक micropipette, एक मस्तिष्क एक P1-p21 कृंतक से बनाया टुकड़ा में रखा गया है. micropipette समानांतर टुकड़ा सतह स्फूर्त है और टुकड़ा मोटाई के माध्यम से पृथक न्यूरॉन्स की मुक्ति में जिसके परिणामस्वरूप कम. पृथक न्यूरॉन्स vibrodissociation के कुछ ही मिनटों के भीतर अध्ययन के लिए तैयार हैं. : इस तकनीक को प्राथमिक neuronal संस्कृतियों, मस्तिष्क स्लाइसें सहित और enzymatically पृथक न्यूरॉन्स के प्रयोग से अधिक लाभ है, बाह्य वातावरण के बेहतर पड़ोसी की कोशिकाओं के प्रभाव से मुक्त नियंत्रण; उपयुक्तता व्यवहार्य अपेक्षाकृत परिपक्व electrophysiological और इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त न्यूरॉन्स के तेजी से उत्पादन और सुधार पूरे सेल टुकड़ा या सेल संस्कृति की तैयारी में न्यूरॉन्स के सापेक्ष रिकॉर्डिंग में अंतरिक्ष दबाना, अच्छी तरह से नियंत्रित औषधीय तेजी से दवा आवेदन और कुल सेल superfusion का उपयोग प्रयोगों के लिए. यह तैयारी synaptic फिजियोलॉजी, औषध विज्ञान, मॉडुलन, और plasticity की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जीवित कोशिकाओं और BOUTONS में दोनों पूर्व और postsynaptic तत्वों की वास्तविक समय इमेजिंग भी संभव vibrodissociated न्यूरॉन्स का उपयोग. पूर्व और postsynaptic तत्वों की आणविक घटकों की विशेषता भी प्रतिरक्षाविज्ञानी और इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण के साथ प्राप्त किया जा सकता है.
सफल vibrodissociation की आवश्यकता है कि स्लाइस स्वस्थ न्यूरॉन्स होते हैं और है कि बीचवाला रिक्त स्थान काफी लचीला न्यूरॉन्स विषाक्त क्षति के बिना टुकड़ा बाहर निकलने के लिए अनुमति. इस प्रकार, तकनीक जल्दी प्रसव के बाद उम्र (P1-21) पर बेहतर काम करता है जब स्वस्थ स्लाइस कम glial / interstiatial सामग्री से वयस्क मस्तिष्क स्लाइसें में पाया जाता है के साथ बनाया जा सकता है है. हमारे अनुभव में, तथापि, टुकड़ा टुकड़ा ही vibrodissociation तकनीक के लिए उल्टा हो सकता है में neuronal अस्तित्व के लिए तैयार करने के अनुकूलन. जबकि हम नियमित के लिए सीटू ठंड संशोधित aCSF जिसमें sucrose कोशिकी ना + और Ca 2 के ज्यादा के लिए प्रतिस्थापित किया गया है + vibrodissociation के लिए तैयार स्लाइस हमारे सामान्य रिकॉर्डिंग aCSF में हो (जैसे कटौती) तैयार कर सकते हैं का उपयोग करते हुए रिकॉर्डिंग में स्लाइस तैयार. जब खुद को स्लाइस में रिकॉर्डिंग के लिए स्लाइस व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से तैयारी हम भी 35 में सामान्य aCSF में स्लाइस ° सेक्शनिंग के बाद बस सी जगह है और उन्हें कमरे के तापमान के लिए लौटने से पहले उन्हें इस तापमान पर 30-60 मिनट के लिए छोड़. हालांकि, vibrodissociation के लिए तैयार स्लाइस तुरंत बस टुकड़ा करने की क्रिया के बाद कमरे के तापमान पर ले जाया जाता है. इन प्रक्रियाओं vibrodissociation के बाद स्वस्थ न्यूरॉन्स, शायद फर्म अंतरालीय ऊतक कि न्यूरॉन्स और अधिक आसानी से टुकड़ा से ही ढीला हिल की अनुमति देता है की कमी के कारण का एक उच्च उपज प्रदान करते हैं. हम exhaustively टुकड़ा तैयारी की स्थिति की जांच की है, जैसा कि हम नियमित रूप से किसी दिए गए दिन पर हमारी रिकॉर्डिंग और इमेजिंग प्रयोगों के लिए पर्याप्त न्यूरॉन्स प्राप्त है. यह संभव है कि टुकड़ा मोटाई या preincubaton प्रक्रियाओं में परिवर्तन के रूप में अतिरिक्त संशोधनों, स्वस्थ न्यूरॉन्स की उपज बढ़ाने के लिए बनाया जा सकता है है. एक सेल उपज बढ़ाने के लिए और बड़े पशुओं में काम करने के लिए तकनीक प्राप्त करने के प्रयास में बहुत हल्के protease उपचार की कोशिश की गई है. हालांकि, बेबदलता भी हल्के protease उपचार synapse कार्य को बाधित करने के लिए लगता है. इस प्रकार, जबकि protease और यांत्रिक हदबंदी अभी भी काम करने के लिए यह तिथि करने के लिए विश्वसनीय नहीं साबित कर दी है अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन्स में पाया जा सकता है के संयोजन.
यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए स्वस्थ न्यूरॉन्स की अपेक्षाकृत कम उपज के बाद vibrodissociation मतलब है कि मुख्य रूप से प्रचुर मात्रा में neuronal उपप्रकारों, मुख्य रूप से प्रक्षेपण न्यूरॉन्स अध्ययन के लिए उपयोगी तकनीक है. उपलब्धता GFP-व्यक्त चूहों में छोटे neuronal subpopulations आसानी से पहचाना जा सकता है है इन दुर्लभ न्यूरॉन्स अध्ययन का मौका बढ़ जाती है. हालांकि, जब तक कि neuronal उपज में सुधार किया जा सकता है है काफी हद तक इन न्यूरॉन्स पर डेटा का संचय अपेक्षाकृत धीमी होने की संभावना है.
कई कदम करने के लिए कैल्शियम संवेदन रंगों के साथ न्यूरॉन्स के सफल लोड करने के लिए महत्वपूर्ण साबित किया है. AM-esterified डाई करने के लिए एक्सपोजर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया है, और हम डाई कम तापमान पर लोड करने की कोशिश कर में असफल रहा है. रंगों की एकाग्रता दोनों लोडिंग समय और तापमान पर विचार के बाद से यह प्रतीत होता है डाई लोडिंग की है कि उच्च एकाग्रता presynaptic BOUTONS में कैल्शियम एकाग्रता कम करती है अनुकूलित किया जाना चाहिए. हमने देखा है कि उच्च सांद्रता के साथ लोड sIPSCs के आयाम और आवृत्ति कम हो जाती है. जब लोड हो रहा है कैल्शियम संवेदन vibrodissociated न्यूरॉन्स के presynaptic टर्मिनलों में रंगों, देखभाल क्योंकि छोटे presynaptic BOUTONS की क्षमता बफरन सोम में से अलग हो सकता है लिया होना चाहिए और BOUTONS के आकार के अनुरूप नहीं हैं. न्यूरॉन युक्त व्यंजन HEPES बफर डाई लोडिंग निम्नलिखित बाहरी समाधान के साथ धो रहे हैं, और धोने के बाद वसूली समय महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए एक अच्छा मुहर बनाने, कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोया होना चाहिए गैर बाहरी सेलुलर झिल्ली से भली भाँति डाई अणु से छुटकारा पाने के.
इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और जीना सेल इमेजिंग के लिए vibrodissociated न्यूरॉन्स का उपयोग करने के अलावा, immunocytochemical तकनीक भी इन 11,12 कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है. कोशिकाओं को आसानी से और तय कर सकते हैं एंटीबॉडी की एक किस्म है, और अन्य सेल मार्कर के साथ दाग. इन कोशिकाओं का उपयोग GABAergic presynaptic टर्मिनलों में प्रोटीन अभिव्यक्ति के दृश्य के लिए एक साफ तैयारी प्रदान करता है. चूहों कि GABAergic न्यूरॉन्स के लिए विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त का प्रयोग अन्वेषक vibrodissociated तैयारी में व्यक्तिगत synaptic टर्मिनलों (चित्रा 1) की पहचान करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार की इमेजिंग फ्लोरोसेंट मार्करों लेजर आधारित माइक्रोस्कोपी और STED तरह नए (उत्तेजना उत्सर्जन रिक्तीकरण माइक्रोस्कोपी) तकनीक का उपयोग टर्मिनलों में रूपात्मक माप के लिए अनुमति दे सकता है. रंजक है कि synaptic पुटिका साइकिल चालन की रिपोर्ट के साथ विज़ुअलाइज़ेशन भी इस तैयारी के साथ संभव है. Akaike और सहकर्मियों styryl डाई, FM1-43 के साथ GABAergic टर्मिनलों लेबल रहने वाले 4 कोशिकाओं में टर्मिनलों कल्पना .
यह भी संभव हो vibrodissociated में प्रोफ़ाइल आरएनए अभिव्यक्ति के लिए एकल कोशिका रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर प्रदर्शन करना चाहिएन्यूरॉन्स. इस तकनीक नियमित enzymatically dissociated न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स सेल संस्कृति में विकसित करने के लिए लागू किया जाता है.
The authors have nothing to disclose.
हम डीआरएस स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. पिंग जून झू और Susumu Koyama तकनीक के प्रारंभिक के दौरान उनकी सहायता के लिए सेट है, और लिखित पांडुलिपि स्वरूपण में सहायता के लिए डॉ. वेरोनिका Alvarez. इस अध्ययन NIAAA के अंदर का नैदानिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान के प्रभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Item | Company | Catalog# | Comments |
Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems Inc. | VT1200S | |
Cell Culture Dish (35 mm) | BD Falcon | 353001 | |
Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
Piezoelectric Manipulator | Exfo-Burleigh | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piezoelectric manipulator |
Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon | TS200 Diaphot | |
EMCCD Camera | ANDOR Technology | iXonEM+ DU-888 | |
Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO Photonics Solutions Inc. | X-Cite 120PC | |
Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes | F14201 |