Vibrodissociation av nervceller från Slices Gnagare Brain att studera synaptisk transmission och bild Presynaptiska Terminaler

Summary

Denna rapport visar en teknik för mekanisk isolering av enskilda livskraftiga nervceller behålla bifogade presynaptiska boutons. Vibrodissociated nervceller har fördelarna med snabb produktion, bra farmakologisk kontroll och förbättrad rymd-clamp utan påverkan från angränsande celler. Denna metod kan användas för avbildning av synaptiska element och patch-clamp inspelning.

Abstract

Mekanisk dissociation av nervceller från det centrala nervsystemet har den fördelen att presynaptiska boutons kvar på den isolerade neuron av intresse. Detta möjliggör för granskning av synaptisk transmission under förhållanden där det extracellulära och postsynaptiska intracellulära miljöer kan kontrolleras väl. En vibration-baserad teknik utan användning av proteaser, som kallas vibrodissociation, är den mest populära metoden för mekanisk isolering. En mikropipett, med spetsen brand poleras till formen av en liten boll, placeras i en hjärna skiva gjord av en P1-P21 gnagare. Den mikropipett är vibreras parallellt med slice ytan och sänkas genom slice tjocklek resulterar i befrielsen av isolerade nervceller. De isolerade nervceller är redo för studier inom ett par minuter vibrodissociation. Denna teknik har fördelar jämfört med användningen av primära neuronala kulturer, skivor hjärnan och enzymatiskt isolerade nervceller inklusive: snabb produktion av livskraftiga, relativt mogen nervceller lämplig för elektrofysiologiska och imaging studier, överlägsen kontroll av den extracellulära miljö fri från påverkan av närliggande celler, lämplighet för välkontrollerade farmakologiska experiment med snabba Drug Application och total cell superfusion samt förbättrad rymd-clamp i helcells-inspelningar i förhållande till nervceller i skiva eller cell förberedelser kultur. Detta preparat kan användas för att undersöka synaptiska fysiologi, farmakologi, moduleringen och plasticitet. Realtid avbildning av både pre-och postsynaptiska element i levande celler och boutons är också möjligt att använda vibrodissociated nervceller. Karakterisering av molekylära beståndsdelar i pre-och postsynaptiska element kan också uppnås med immunologiska och bildgivande metoder.

Protocol

1. Förbereda Flame förslutna glas Mikropipett

1. Använda mikroelektrod glas, dra en vanlig patch-clamp mikropipett på en Flaming-Brown eller motsvarande mikropipett avdragare (tips diameter ~ 2 mikrometer). Placera mikropipett spets i lågan från en Bunsenbrännare för ~ 2 sek tills en smält boll former med en diameter på 200-300 ìm.
2. Placera låga förslutna plåster pipett på hållare på en mikromanipulator som snabbt kan vibreras sida till sida (reseavståndet 100-200 mikrometer) med hjälp av en piezoelektrisk bimorph, relä, eller ekvivalent effektiv enhet.

2. Förbereda hjärnan skivor från P1-P21 råttor eller möss

1. Förbered konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) med följande sammansättning (i mm): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, och 10 D-glukos. Bubble lösning med 95% syrgas / 5% CO _2-gas för ~ 15 minuter, tillsätt sedan 2 mM CaCl ₂ och 1 mm MgCl _2.
2. Kapning hjärnan skivor:
   1. Bedöva djur med halotan eller isofluran. Halshugga djur - ta bort hjärnan - blockera hjärnan i önskad riktning (koronalt parasagittal, tvärgående, etc.) till att omfatta områden av intresse.
   2. Fäst blockerade hjärnan till stadiet av en vibrerande hjärna slicer nedsänkt i aCSF - avsnitt hjärnan på 250-400 ìm tjocklek - placera skivor i aCSF bubblade med carbogen i en "preinkubation" kammare om nettning som möjliggör vätska / gas exponering på alla ytor - gör skivor till jämvikt i detta medium i minst en timme.

3. Vibrodissociation

1. Fyll en 35 mm maträtt diameter kultur HEPES buffrad-saltlösning med följande sammansättning (mm): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl _2, 2,5 CaCl _2, 10 D-glukos med pH satt till 7,4 med NaOH och osmolaritet anpassas till ~ 300 mOsm med sackaros. Kultur rätter kan vara avstängning rätter, standard cell rätter kultur, mat kultur med insatser glas täckglas eller rätter belagda med, t ex poly-L-lysin, beroende på behovet av starkare cell anslutning till skålen botten.
2. Placera skiva i kulturen skålen och visualisera med en dissekera stereoskopet på 250 x. Håll skiva till botten med hjälp av en böjd platinatråd (0,5 mm diameter) placeras på ovansidan för den del att agera som en vikt.
3. Placera spetsen av lågan förslutna mikropipett på skiva ytan i önskad hjärnan regionen. Aktivera mikromanipulator att vibrera spetsen sidled vid 10-30 Hz, med utflykt sträcka ~ 100 ìm. Använda mikromanipulator, flytta spets djupare i segmentet vävnaden så att den passerar genom hela skiva inom ~ 30 sek. Upprepa detta steg som behövs för att maximera antalet isolerade nervceller erhållas från en viss hjärna region.
4. Tag bort från skiva - plocka upp segmentet med pincett och skaka den försiktigt men ändå i lösning - ta sedan bort skiva helt och kasta.
5. Låt dissocierade celler att bosätta sig och hålla sig till skålen längst ner i minst 10 min.

4. Elektrofysiologiska inspelning

1. Placera skålen innehåller nervceller på scenen av ett inverterat mikroskop och visualisera med 10 x och 63 x mål. Leta efter nervceller med en smidig patent membran, ingen blebbing och en påvisbar, men inte överdimensionerad kärna. Om faskontrast optik används, leta efter fas-ljus nervceller med en gul-nyans, inte för blå. Superfuse celler med extracellulära lösning med önskad salter, näringsämnen, antagonister, etc. (vår standard är den HEPES-saltlösning som nämns ovan (avsnitt 3.1)), ofta kompletterat med 5 mikroM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] kinoxalin-7-sulfonamid dinatrium (NBQX) och 25-100 mikroM D-2-amino-5-phosphonopentanoic syra (AP5) för att blockera receptorer ionotropic glutamat som gör det möjligt för isolering av snabba GABA _En receptormedierad IPSCs ^1,2.
2. Dra en vanlig patch mikropipett med hjälp av en Flaming-Brown eller motsvarande avdragare. Pipettspetsen motståndet bör vara 2-4 Mohm (beroende på målcellen storlek) när den är fylld med en Cl ^{- -} ​​baserad lösning.
3. Upprätta ett helcells-inspelning från en visualiseras neuron med hjälp av vanliga elektrofysiologiska tekniker.
4. Spela spontan postsynaptiska strömmar (sPSCs) med en lucka utan datainsamling protokollet. Applicera 0,2-1 mikroM tetrodotoxin och / eller låg Ca ^{2 +} - innehållande extracellulära lösning för att spela in miniatyr postsynaptiska strömmar (mPSCs).
5. Lösningar och farmakologiska agenter kan direkt appliceras på celler. Vi använder lokala superfusion från smält fyrkantig spets glasrör med lösning utbyte med laterala rörelse slang monterad på en stepper-motordriven mikromanipulator. Detta allovar för lösning utbyte i 10s för 100-tals ms att åstadkomma snabba förändringar av extracellulärt molekylär innehåll, tillämpning av receptoragonister, etc.
6. Akaike och kollegor har utvecklat metoder för att stimulera enstaka presynaptiska boutons ^3,4. En mikropipett är placerad nära en visualiseras Bouton och stimulering ges (negativ stimulans strömmar av 5-10 μA, 0,1-0,2 ms varaktighet). Unitary IPSCs registreras och metoder såsom metoden för misslyckanden kan användas för att undersöka förändringar i presynaptiska och postsynaptiska funktion.

5. Imaging Presynaptiska Terminaler

1. Postsynaptiska nervceller kan fyllas med olika färgämnen via patch pipetten. Nervceller kan också göras från möss som uttrycker fluorescerande proteiner (FPS) som grönt fluorescerande protein (GFP) i utvalda cellpopulationer.
2. Presynaptiska terminaler kan visualiseras på vibrodissociated nervceller gjorda av möss som uttrycker FPS i synnerhet interneuron populationer. Till exempel möss som uttrycker GFP drivs av glutamat decarboxylase 65 (GAD65) promotor visar grönt somata och processer i hippocampus korg celler och andra interneuronen. Vibrodissociated pyramidala nervceller i hippocampus CA1 regionen har GFP-positiva axonet terminaler apposed till sina somata och proximala dendriter (Figur 1A). Pyramidala nervceller vibrodissociated från möss som uttrycker synaptopHlourin (ett pH-känsligt GFP mutant smält till det synaptiska vesikler-associerad VAMP2 protein) under kontroll av Thy1 promotor även FP-positiva bifogade boutons som visar pH-känsliga fluorescens (figur 1B).
3. Presynaptiska boutons kan laddas med färgämnen kalcium indikator och andra fluorescerande molekyler med AM-förestrade föreningar ^5. Figur 2 visar ett exempel på lastning med kalcium-indikatorn dye Fluo4-AM. Först 1-2 mikroM AM-förestrade färg appliceras på nervceller vid 37 ° i 10 min. Dye kan tränga in i intracellulära miljön, där esteraser klyva molekylen, vilket ger fri, cell-impermeant och OSLÄCKT färgämne. Detta tillvägagångssätt belastningar både pre-och postsynaptiska cellulära element. Efter lastning, är cellerna tvättas med HEPES buffrad-saltlösning och hålls vid 37 ° i ytterligare 10 min. Innan att göra en GΩ-tätning med en glaspipett elektrod, är de celler sköljas 3 gånger med externa buffrad lösning.
4. En hel-cell inspelning är då fastställas med hjälp en dye-fri intracellulära lösning. Efter 2-5 minuter av inspelning är färgen oftast bort från postsynaptiska neuron, vilket möjliggör visualisering av Fluo-4-laddad synaptisk boutons. Denna teknik var uppfunnen av Ye et al ^5.
5. Färgen-loaded boutons kan sedan visualiseras med hjälp av en hög förstoring, hög numerisk apertur mål med antingen en kamera-eller multiphoton mikroskop. Samtidig helcells-inspelning och kalcium avbildning kan uppnås med en uppställning som visas i figur 3. Bilderna av neuron och boutons visas i figur 2C fångades med en elektron multiplicera Charge Coupled Device (EMCCD) kamera. Kraften i ljuskälla för excitation var dämpas till 1,2% med en neutral densitet 1,0 filter och en iris-filter justeras till 12% utgång. Kalcium transienter från den gröna presynaptiska boutons kan observeras och registreras i realtid, och mätte offline.

6. Representativa resultat:

Spontan och Aktuellt Injection-Evoked Avfyrning av Vibrodissociated Neuroner

Inspelningar från en typisk vibrodissociated hippocampus CA1 pyramidala neuron visas i figur 4A. Spontan överskridande aktionspotentialer kan observeras i pyramidala nervceller skiljas från råtta basolateral amygdala, hippocampus och VTA ^1,5. Under innevarande-clamp inspelningar från CA1 pyramidal nervceller, hyperpolarizing aktuella injektion producerar typiska spänningen svar medan depolariserande ström tillräckligt stark framkalla potentialer överskridande verksamhet med den typiska försenade bränning mönster med måttlig nuvarande nivåer och icke-tillmötesgående potentialer åtgärder till följd av en starkare ström injektion ( Figur 4B).

Spontan och Miniatyr GABAergic hämmande postsynaptiska Strömmar i Vibrodissociated Neuroner

Under spänning-clamp inspelningar med en CsCl-baserad intracellulära lösning, är spontana synaptiska strömmar observeras (Figur 5A). Dessa händelser elimineras i låga kalcium-innehållande lösning ^2,6 och i de flesta neuronala typerna är helt blockerad av GABA _A-receptorn antagonister såsom bicuculline eller gabazine (Figur 5B, C), vilket indikerar att dessa är sIPSCs medierad av GABA-släpp och aktivering av denna ionotropic receptor subtyp. Men i princip nervceller från hjärnan regioner som basolateral amygdala ² och den ventrala tegmentumområdet ^5,7, GABA _A-receptorn blockadavslöjar kortare EPSCs medierad av glutamaterg aktivering av AMPA-typ receptorer. Intressant, minskar tillämpning av TTX vid koncentrationer som är specifika för blockad av de mest toxin-känsliga spänningskänsliga natriumkanaler frekvens och amplitud sIPSCs observerats i vibrodissociated nervceller från flera delar av hjärnan (Figur 6A) ^2,4,7. Således deltar natrium kanal aktiviteten i GABA släpper i kläm-off synaptisk boutons. Det är ännu inte klart om fullt utvecklad natrium aktionspotentialer förekommer i dessa terminaler. Det är värt att notera att ingången motstånd väl tillsluten 1 mikrometer diameter Axon terminalen kommer sannolikt att vara långt in på GΩ sortiment. Således kan öppnas även ett litet antal natriumkanaler vara tillräcklig för att depolarize terminaler för att aktivera kalciumkanaler som förmedlar kopplingen excitation sekretion. När det gäller dessa kalciumkanaler, tyder tecken på att N och P / Q-typ kanalerna delta i frigivning vid GABAergic terminaler i vibrodissociated preparat av hippocampus CA1 och på andra håll ^8.

Modulering och plasticitet för överföring av ett antal signalsubstanser och receptorer har undersökts med hjälp av vibrodissociated nervceller ^3,4,9. De signalsubstanser visat sig ha en sådan begränsande åtgärder är adenosin, GABA, serotonin, endocannabinoids etc ^{2,6,10,11,12.} Dessutom har kortsiktiga synaptisk plasticitet, som endocannabinoida beroende depolarisation-inducerad hämning av hämning (DSI) också beskrivs i denna beredning ^2,11. Fynden talar för att många former av receptor-medierad och trans-synaptisk signalering av endogena neuromodulators är intakta i vibrodissociated beredning.

Kalcium transienter och vesikulär Släpp i Axon terminaler i Vibrodissociated Förberedelser

Använda EMCCD utrustade inverterat mikroskop beskriver ovan har vi granskat kalcium transienter i presynaptiska terminaler i vibrodissociated neuron-Bouton beredning. Figur 2 visar cell lastning med AM-förestrade Fluo-4 och efterföljande postsynaptiska färgämnet utspädning i ett hippocampus CA1 pyramidal neuron. Spontana kalcium transienter observeras i vissa färg-fyllda boutons visas som regioner av intresse (ROI) i figur 6B. Tillämpning av 1 mikroM tetrodotoxin (TTX) eliminerar dessa spontana transienter, vilket indikerar att de förmedlas av aktivering av spänningskänsliga natriumkanaler strömmar som spontant aktiveras i boutons, vilket leder till efterföljande kalcium stiger. Ökad extracellulära KCl från 10 mm till 40 mm med snabb lösning utbyte ger ökad fluorescens mätt i Rois som motsvarar presynaptiska terminaler (Figur 7A). Samtidig inspelning från postsynaptiska neuron används för att övervaka sIPSCs och avgöra om händelsen frekvensen ökar med hög K ⁺ depolarisation (Figur 7b).

Att visualisera vesikelfusion i presynaptiska boutons har vi använt möss som uttrycker synaptopHlourin konstruera under kontroll av de Thy1 promotor (märkt spH21 mus). SynaptopHluorin i en molekylär konstruktion där ekliptikan pHlourin (en GFP mutant med ökad pH-känslighet) ¹² är kopplad till vesikler tillhörande membranprotein (VAMP2) ^13. Detta arrangemang förlägger pHlourin motiv i vesikler lumen där relativt sura miljö släcker fluorescens. När vesikelfusion detta motiv utsätts för mer neutrala extracellulära miljö med en resulterande ökning i fluorescens vid puncta som motsvarar vesikler / presynaptiska terminaler. Vibrodissociation av hippocampus neuroner från spH21 möss möjliggör visualisering av fluorescerande puncta storlek och läge förväntas för GABAergic terminaler (Figur 8A). Tillämpning av hög K ⁺ - som innehåller extern lösning ökar fluorescens i dessa terminaler, och denna effekt är blockerad i närvaro av en extern lösning där extracellulärt kalcium minskar till 0,2 mm (Figur 8B). Således verkar det depolarisation-inducerad ökning av fluorescens för att spegla excitation-sekretion koppling till GABAergic synapser i neuron-Bouton beredning.

Förmågan att mäta presynaptiska kalcium transienter och vesikelfusion i axonet terminaler av neuron-Bouton förberedelser ger oss möjlighet att undersöka effekterna av neuromodulators, droger av missbruk och synaptisk plasticitet på presynaptiska mekanismer som är inblandade i excitation-sekretion koppling och exocytos / endocytos. Dessa tekniker kan också kombineras med andra molekylära verktyg och genetiskt modifierade möss för att undersöka vilken roll särskilda proteiner i presynaptiska funktion och modulering / plasticitet.

Figur 1. Vibrodissociated nervceller från hippocampus CA1 regionen (A) Sammanslagen bild av DIC ennd grön fluorescens bilder från en GAD65 mus. DIC bild samman för att tydligt visa de platser där de gröna terminaler (B) Fluorescens bild från en synaptophluorin (spH21) mus. Skala = 10 mikrometer

Figur 2 Kalcium indikator-lastning förfarande: (A) hela cellen är laddad med AM-förestrad färg, (B) helcells-inspelning späder färg, (c) terminaler visualiseras som områden av intresse (pilspetsar)..

Figur 3. Schematisk beskrivning av experimentuppställning för samtidig helcells-inspelning och kalcium avbildning i presynaptiska terminaler på vibrodissociated nervceller. EMCCD = elektron multiplicera laddning kopplad enhet.

Figur 4. Representant vågformer visar (A) spontana aktionspotentialer från en vibrodissociated CA1 neuron och (B) membran spänning svar på hyperpolarizing och depolariserande ström injektioner i nuvarande-clamp inspelningar från en CA1 neuron.

Figur 5. (A) representant vågformer spontana IPSCs från en CA1 pyramidal neuron. (BC) Den IPSCs blockerades av antingen gabazine (10 mikroM, B) eller bicuculline (20 mikroM, C).

Figur 6. TTX hämmar spontana GABAergic synaptisk transmission, och eliminerar presynaptiska kalcium transienter i vibrodissociated hippocampus beredning. (A) Inspelning från en vibrodissociated neuron före och under TTX ansökan. Notera minskningen i frekvens och amplitud sIPSCs. (B) Kalcium transienter observerats i en Fluo-4-laddad presynaptiska terminalen på en vibrodissociated neuron före och under TTX ansökan. Notera fullständig förlust av transienter.

Figur 7. Samtidig kalcium indikator avbildning och sIPSC helcells-inspelning som visar effekterna av höga K ⁺ stimulering. (A) Fluorescens mäts över tid från en presynaptisk Bouton laddad med Fluo-4:00 färgämne. (B) samtidig ökning av sIPSC frekvens och amplitud under hög K ⁺ ansökan.

Figur 8. ^{Ca2 +-beroende} hög K ⁺ svar i presynaptiska boutons av spH21 pyramidal neuron från hippocampus CA1 regionen. (A) Fluorescens bild av en vibrodissociated neuron. (B) Hög-K ^+-program (markerad med svart streck) resulterade i en ihållande ökning av fluorescens i närvaro av vår normala extracellulära ^{Ca2 +-innehållande} lösning (2 mM Ca2 ^+). Ingen fluorescens Ökningen sågs vid låga extracellulära ^{Ca2 +} (0,2 mm Ca ^{2 +).} Data i diagrammet normaliserades till redan höga K ⁺ fluorescens nivåer, och visar genomsnittligt svar från 3 boutons.

Discussion

Framgångsrik vibrodissociation kräver att skivorna innehåller friska nervceller och interstitiell utrymmen är flexibla nog att låta nervceller att avsluta segmentet utan toxiska skador. Således fungerar tekniken optimalt vid tidig postnatal åldrar (P1-21) när friska skivor kan göras med mindre gliaceller / interstiatial material än vad som förekommer i skivor vuxna hjärnan. Vår erfarenhet är dock att optimera slice förberedelse för neuronal överlevnad i segmentet sig kan vara kontraproduktivt för vibrodissociation tekniken. Medan vi förbereder rutinmässigt skivor för in situ-inspelning med kallt modifierad aCSF som sackaros har ersatts för mycket av den extracellulära Na ⁺ och Ca ^{2 +,} skivor beredd på vibrodissociation kan förberedas (t.ex. cut) i vår normala inspelning aCSF. När man förbereder skivor för inspelning från enskilda nervceller i skivor själva vi också skivor i normal aCSF vid 35 ° C precis efter sektionering och lämnar dem i 30-60 minuter vid denna temperatur innan tillbaka dem till rumstemperatur. Men skivor förberedda för vibrodissociation flyttade omedelbart till rumstemperatur strax efter skivning. Dessa förfaranden ger en högre avkastning av friska nervceller efter vibrodissociation, kanske på grund av bristen på fasta interstitiell vävnad som gör att nervceller att vara lättare skakas loss från segmentet själv. Vi har inte uttömmande undersökt villkoren skiva förberedelser, som vi rutinmässigt få tillräckligt med nervceller för vår inspelning och experiment avbildning på en viss dag. Det är möjligt att ytterligare ändringar, såsom ändringar i slice tjocklek eller förfaranden preincubaton kan göras för att öka avkastningen av friska nervceller. Mycket milt proteas behandlingar har prövats i ett försök att öka cellen avkastningen och få tekniken att fungera i äldre djur. Men alltid med mild proteas behandling verkar störa synaps funktion. Således, medan kombinationen proteas och mekaniska dissociation kan fortfarande hittas för att arbeta inte har visat sig vara tillförlitliga i framhjärnan nervceller hittills.

Det bör också noteras den relativt låga avkastningen av friska nervceller efter vibrodissociation innebär att tekniken är främst användbart för att studera riklig neuronala subtyper, främst projektion nervceller. Tillgången på GFP-uttryckande möss där små neuronala subpopulationer lätt kan identifieras ökar chansen att studera dessa ovanligare nervceller. Men om neuronala avkastningen kan förbättras avsevärt ansamling av uppgifter om dessa nervceller kommer sannolikt att vara ganska långsam.

Flera steg har visat sig vara avgörande för framgångsrik lastning av nervceller med kalciumavkännande färgämnen. Exponering för AM-förestrade färg utförs vid 37 ° C, och vi har tappat målet att försöka färga belastning vid lägre temperaturer. Koncentrationen av färgämnen bör optimeras med tanke på både laddningstid och temperatur eftersom det verkar som högre koncentration av färgämnet-loading sänker kalciumkoncentrationen i presynaptiska boutons. Vi har observerat att ladda med högre koncentrationer minskar frekvensen och amplituden för sIPSCs. När du laddar kalciumavkännande färgämnen i presynaptiska terminalerna vibrodissociated nervceller, måste man vara försiktig eftersom buffringskapacitet av de små presynaptiska boutons kan vara annorlunda än i soma och storlekar av boutons inte är konsekventa. Neuron som innehåller rätter tvättas med HEPES buffrad-extern lösning efter dye-lastning, och återhämtningstiden efter tvättning är avgörande. Förutom att göra en bra tätning för helcells-inspelning, måste cellerna tvättas noggrant för att bli av med icke-internaliserade färg molekyler från den yttre cellulära membran.

Förutom att använda vibrodissociated nervceller för elektrofysiologi och levande cell imaging kan immuncytokemiska metoder också tillämpas på dessa celler ^11,12. Celler lätt kan fastställas och färgas med olika antikroppar, och andra markörer cellen. Användningen av dessa celler ger en ren förberedelse för visualisering av proteinuttryck i GABAergic presynaptiska terminaler. Använda möss som uttrycker fluorescerande proteiner under kontroll av initiativtagarna är specifika för GABAergic nervceller kan utredaren att identifiera enskilda synaptiska terminaler i de vibrodissociated beredningen (Figur 1). Imaging fluorescerande markörer av denna typ kan tillåta morfologiska mätningar i terminalerna med hjälp av laserbaserad mikroskopi och nyare tekniker som Plats (stimulering Emission Depletion mikroskopi). Visualisering med färgämnen som rapporterar synaptiska vesikler cykling är också möjligt med denna beredning. Akaike och medarbetare har märkt GABAergic terminaler med styryl färg, FM1-43 för att visualisera terminaler i levande celler ^4.

Det bör också vara möjligt att utföra encelliga reverse transkriptas PCR att profilera RNA-uttryck i vibrodissociatednervceller. Denna teknik är rutinmässigt tillämpas enzymatiskt-differentierade nervceller och nervceller som odlas i cellkultur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibrating Tissue Slicer	Leica Microsystems	VT1200S
Cell Culture Dish (35 mm)	BD Biosciences	353001
Glass Bottom Dishes	Willco-dish	GWSB-5040 Or GWSB-3522	0.16-0.19 mm glass thickness for imaging
Piez–lectric Manipulator	EXFO	LSS-3000	Could also use relay, etc.
SD9 Square Pulse Stimulator	Grass Technologies	SD9K	For triggering piez–lectric manipulator
Dissecting Stereoscope	Wild Heerbrugg	TYP 374590	Could also use any stereoscope
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW-150F-4	For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette
Six Channel Perfusion Valve Control Systems	Warner Instruments	VC-6 or VC-6M
Perfusion Fast-Step	Warner Instruments	SF-77B
Inverted Microscope with 20-63x objectives	Nikon Instruments	TS200 Diaphot
EMCCD Camera	Andor	iXonEM+ DU-888
Excite Fluorescence Illumination Light Source	EXFO	X-Cite 120PC
Fluo-4, AM calcium indicator	Molecular Probes, Life Technologies	F14201