דו"ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.
מכונות דיסוציאציה של נוירונים ממערכת העצבים המרכזית יש את היתרון כי boutons presynaptic להישאר מחובר נוירון בודד של עניין. זה מאפשר בדיקה של שידור הסינפטי בתנאים שבו סביבות תאיים תאי ו postsynaptic ניתן לשלוט היטב. טכניקת הרטט מבוססי ללא שימוש פרוטאזות, המכונה vibrodissociation, היא הטכניקה הכי פופולרי עבור בידוד מכני. Micropipette, עם קצה אש מלוטשת לצורת כדור קטן, מכניסים פרוסת המוח עשוי מכרסם P1-p21. Micropipette הוא רטט במקביל פני פרוסת והוריד דרך עובי פרוסת והתוצאה היא שחרור של נוירונים בודדים. נוירונים בודדים מוכנים ללמוד בתוך דקות ספורות של vibrodissociation. טכניקה זו יתרונות על פני השימוש של תרבויות העצבית העיקרי, פרוסות המוח נוירונים בודדים enzymatically כולל: ייצור מהיר של נוירונים קיימא בוגרת יחסית מתאים מחקרים אלקטרו הדמיה, שליטה מעולה של הסביבה תאיים ללא השפעה של תאים שכנים, התאמתו עבור מבוקר היטב ניסויים תרופתי באמצעות תרופות יישום מהיר הכולל תא superfusion; ושיפור חלל מהדק כולה תא הקלטות יחסית נוירונים פרוסה או תרבות ההכנות התא. הכנה זו יכולה לשמש כדי לבחון הפיזיולוגיה סינפטית, פרמקולוגיה, אפנון הפלסטיות. בזמן אמת הדמיה של שני אלמנטים טרום postsynaptic בתאים boutons החיים ניתן גם באמצעות נוירונים vibrodissociated. אפיון המרכיבים המולקולריים של יסודות טרום postsynaptic יכול גם להיות מושגת עם גישות אימונולוגיות הדמיה מבוססת.
Vibrodissociation מוצלח דורש כי פרוסות מכילים נוירונים בריא כי רווחים ביניים גמישים מספיק כדי לאפשר נוירונים כדי לצאת ללא נזק פרוסה רעילים. לכן, השיטה עובדת בצורה אופטימלית בגיל מוקדם לאחר הלידה (P1-21) כאשר פרוסות בריא יכול להתבצע עם חומר גליה פחות / interstiatial מאשר נמצא פרוסות המוח הבוגר. מניסיוננו, לעומת זאת, אופטימיזציה הכנה פרוסה להישרדות העצבית פרוסה עצמו עשוי להיות מועיל עבור הטכניקה vibrodissociation. הואיל ואנו שגרתי להכין פרוסות עבור הקלטה באתרו באמצעות aCSF שונה קר שבו סוכרוז כבר להחליף הרבה של תאי Na + ו – Ca 2 +, פרוסות מוכן vibrodissociation יכול להיות מוכן (חתך למשל) ב aCSF הקלטה הרגיל שלנו. בעת הכנת פרוסות הקלטה מתא עצב בודדים את פרוסות עצמם יש לנו גם מקום פרוסות aCSF נורמלי ב 35 ° C רק לאחר חתך ולהשאיר אותם במשך 30-60 דקות בטמפרטורת זה לפני החזרה אותם לטמפרטורת החדר. עם זאת, פרוסות מוכן vibrodissociation מועברים מיד לטמפרטורת החדר מיד לאחר חיתוך. נהלים אלה לספק תשואה גבוהה יותר של נוירונים בריא לאחר vibrodissociation, אולי בשל חוסר של רקמת חברת ביניים המאפשר נוירונים להיות מזועזע בקלות רבה יותר משוחרר מכל פרוסה עצמו. אנחנו לא בחנו ממצה הכנה התנאים פרוסה, כפי שאנו שגרתי להשיג נוירונים מספיק הקלטה שלנו ניסויים הדמיה ביום נתון. יתכן כי שינויים נוספים, כגון שינויים עובי פרוסת או נהלים preincubaton, יכול להיות עשוי להגדיל את התשואה של נוירונים בריא. טיפולים פרוטאז קלה מאוד נוסו במאמץ להגדיל את תפוקת התא ולקבל את הטכניקה לעבוד אצל בעלי חיים מבוגרים יותר. עם זאת, תמיד אפילו טיפול פרוטאז קלה נראה לשבש תפקוד הסינפסה. וכך, בעוד השילוב של פרוטאז מכני דיסוציאציה עדיין עשויים למצוא עבודה זה לא הוכיח אמין בנוירונים forebrain עד כה.
ראוי גם לציין את התשואה הנמוכה יחסית של נוירונים בריא לאחר vibrodissociation כלומר טכניקה זו שימושית בעיקר ללימוד תת נוירונים בשפע, בעיקר נוירונים ההקרנה. הזמינות של ה-GFP-לבטא בעכברים שבהם subpopulations עצבי קטן ניתן לזהות בקלות מגדיל את הסיכוי של לימוד נוירונים אלה נדירים. עם זאת, אם התשואה העצבית ניתן לשפר במידה ניכרת הצטברות של נתונים על הנוירונים האלה עשוי להיות איטי יחסית.
צעדים אחדים הוכיחו להיות מכריע עבור טעינת מוצלח של נוירונים עם סידן חישה צבעים. חשיפה לצבוע AM-esterified מבוצע על 37 ° C, ואנחנו לא הצליחו מנסה לצבוע עומס בטמפרטורות נמוכות יותר. ריכוז של צבעים צריך להיות מותאם בהתחשב הן זמן הטעינה והטמפרטורה מאז נראה כי ריכוז גבוה של העמסה, לצבוע מוריד ריכוז סידן boutons presynaptic. ראינו כי הטעינה עם ריכוזים גבוהים יותר מקטין את תדירות את המשרעת של sIPSCs. בעת טעינת סידן חישה צבעים לתוך מסופי presynaptic של נוירונים vibrodissociated, יש להקפיד כי קיבולת חציצה של boutons presynaptic קטן עשוי להיות שונה מזה של סומה ואת הגדלים של boutons אינן עקביות. Neuron המכילים מנות נשטפים עם פתרון HEPES שנאגרו חיצוני הטעינה הבאה, צבע, ואת זמן ההחלמה לאחר כביסה הוא קריטי. בנוסף, כדי להפוך את חותם טוב הקלטה שלם תאים, התאים יש לרחוץ ביסודיות להיפטר הלא הפנימו מולקולות צבען של קרום התא החיצוני.
בנוסף לשימוש נוירונים vibrodissociated הדמיה תא electrophysiology ולחיות, טכניקות immunocytochemical יכול להיות מיושם גם על תאים אלה 11,12. תאים ניתן לתקן בקלות ומוכתמת עם מגוון רחב של נוגדנים, וסמנים תאים אחרים. השימוש בתאים אלה מספק הכנה נקי להדמיה של ביטוי החלבון מסופי presynaptic GABAergic. שימוש בעכברים המבטאים חלבוני ניאון בשליטת היזמים ספציפית נוירונים GABAergic מאפשרת לחוקר לזהות המסופים הסינפטיים הפרט בהכנת vibrodissociated (איור 1). סמנים הדמיה פלורסנט מסוג זה עשוי לאפשר מדידות מורפולוגיים באמצעות מסופים מבוססי לייזר מיקרוסקופיה וטכניקות חדשות יותר כמו STED (פליטה גירוי מיקרוסקופית דלדול). ויזואליזציה עם צבעים כי הדו"ח אופניים שלפוחית סינפטית הוא גם אפשרי עם הכנה זו. Akaike ועמיתים לעבודה יש שכותרתו מסופי GABAergic עם צבע styryl, FM1-43 לדמיין מסופי בתאים חיים 4.
זה צריך להיות גם ניתן לבצע תא בודד הפוכה transcriptase PCR ביטוי RNA פרופיל vibrodissociatedנוירונים. טכניקה זו מיושמת באופן שגרתי enzymatically-ניתק נוירונים נוירונים גדל בתרבות התא.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להכיר בני הזוג. פינג יוני Zhu ו סוסומו Koyama על סיועם במהלך הראשונית להגדיר של הטכניקה, וד"ר ורוניקה אלווארז לסיוע עיצוב את כתב היד נכתב. מחקר זה מומן על ידי המחלקה למחקר קליני ביו עירונית של NIAAA.
Item | Company | Catalog# | Comments |
Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems Inc. | VT1200S | |
Cell Culture Dish (35 mm) | BD Falcon | 353001 | |
Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
Piezoelectric Manipulator | Exfo-Burleigh | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piezoelectric manipulator |
Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon | TS200 Diaphot | |
EMCCD Camera | ANDOR Technology | iXonEM+ DU-888 | |
Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO Photonics Solutions Inc. | X-Cite 120PC | |
Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes | F14201 |