Summary
Un método de ingeniería de tejidos único fue desarrollado para alargar las fibras nerviosas en numerosos cultura con una recapitulación de crecimiento de los axones se extienden, una forma de crecimiento del sistema nervioso por el que los nervios se alargan en conjunto con el crecimiento del cuerpo aumentando.
Abstract
Durante la pre-sináptica desarrollo embrionario, los procesos neuronales recorrer distancias cortas para alcanzar sus objetivos a través del cono de crecimiento. Con el tiempo, somata neuronal están separados de sus terminales de los axones, debido al crecimiento del esqueleto del organismo ampliación (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Este mecanotransducción induce un modo secundario de crecimiento neuronal capaz de acomodar el alargamiento continuo del axón (Bray 1984; Heidemann y Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al, 1995;. Pfister, Iwata et al 2004)..
Crecimiento de los axones Stretch (ASG) es posiblemente un factor central en la maduración de los procesos a corto embrionarias en los nervios de largo y tractos de sustancia blanca característica del sistema nervioso adulto. Para el estudio de ASG in vitro, la ingeniería biorreactores para aplicar tensión a los procesos a corto axonal de cultivos neuronales (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aquí se detallan los métodos que usamos para preparar y llevar a cabo biorreactores ASG. En primer lugar, dentro de cada carril de estiramiento de los biorreactores, las neuronas se colocan sobre un sustrato de micro-manipulación de remolque. A continuación, las neuronas regenerar sus axones, a través de la extensión cono de crecimiento, en un sustrato fijo. Por último, el crecimiento de estiramiento se realiza remolcando el cuerpo celular plateado de los terminales de los axones adherido al sustrato fijo, recapitulando el crecimiento esquelético después de la extensión cono de crecimiento.
El trabajo previo ha demostrado que la ASG de embriones de ratas las neuronas dorsales raíz de los ganglios son capaces de las tasas de crecimiento sin precedentes hasta 10mm/day, alcanzando una longitud de hasta 10 cm, mientras que al mismo tiempo que resulta en un aumento de diámetro axonal (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Esto está en marcado contraste con la extensión de regeneración cono de crecimiento (en ausencia de estímulos mecánicos), donde las tasas de crecimiento promedio 1mm/day con éxito la regeneración limitada a longitudes de menos de 3 cm (Fu y Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). En consecuencia, un mayor estudio de ASG puede ayudar a revelar los mecanismos de desregulación de crecimiento que limitan la regeneración en la ausencia de estímulos mecánicos.
Protocol
1. Panorámica del sistema de estiramiento Axón biorreactor de crecimiento
- Dos enfoques predominantes han sido utilizados para aplicar fuerzas en los experimentos a las neuronas. En el primer enfoque, las fuerzas se aplican a toda la neurona (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). En el segundo enfoque, las fuerzas se aplican directamente sobre el axón tirando del cono de crecimiento. El uso de agujas de cristal, este último enfoque ha sido utilizado para la formación de los nuevos modelos axón (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O'Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), para identificar los umbrales de la fuerza para la elongación y retracción (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al, 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), y analizar la agrupación de neurotransmisores en terminales de los axones (Siechen, Yang et al 2009).. Una extensión de la ingeniería de tejidos únicos de este método fue desarrollado para producir grandes estructuras nerviosas con un crecimiento de los axones estiramiento automático (ASG) sistema de biorreactor (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Recientemente, hemos desarrollado una versión en miniatura del sistema de biorreactor para estudiar microscópicamente ASG en tiempo real (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aquí, le detallamos el protocolo de 9 días (tabla 1) que actualmente utilizamos para preparar y llevar a cabo ASG biorreactores de forma rutinaria.
- Operación general: El sistema de biorreactor de ASG se compone de tres componentes principales: 1) una cámara de biorreactor con carriles independientes (alargada pozos) donde las neuronas se cultivan y se estiró, 2) una mesa automatizada de movimiento lineal para aplicar las fuerzas de estiramiento y 3) un motor paso a paso Controlador de unidad con el software para controlar el crecimiento tramo (figura 1).
- En pocas palabras, la fabricación de prototipos de reactor biológico se llevó a cabo en un taller mecánico con una fresadora vertical (Bridgeport, Elmira, Nueva York). Para la biocompatibilidad, la facilidad de la esterilización y la durabilidad, los componentes internos de reactor biológico fueron mecanizadas a partir de 3 / 8 "polieteretercetona (PEEK). Transparente de policarbonato se utiliza para las tapas para permitir la microscopía de luz y de visión de las culturas. Resistentes a la corrosión 316 tornillos de acero inoxidable y hardware completa la asamblea (McMaster-Carr, Elmhurst, IL).
- La cámara de biorreactor se compone de un marco de estiramiento que se forma 3 carriles, un bloque de remolque ajustable que manipula las células a través de los carriles, y que sobresalen las barras de remolque de la manipulación externa (figura 2). Cultivos neuronales son sembradas en los sustratos disponibles Aclar cultura remolque apoyado por el bloque de remolque (figuras 2 y 3). Un sustrato cubreobjetos estacionaria desechables se adhiere a la parte inferior del marco se extiende y abarca todos los 3 carriles. Antes de estiramiento, las neuronas plateado se debe extender axones del sustrato de remolque en el sustrato fija a través de la extensión cono de crecimiento. La población de los axones que unen los sustratos se sometan posteriormente se extienden por el desplazamiento del bloque de control de tracción.
- La mesa automatizada de movimiento lineal se compone de un motor paso a paso (HT23-397, Applied Productos Motion, Watsonville, CA) y la tabla de movimiento lineal (MIPS-2-10-1.0mm, servosistemas, Monteville, NJ) montado en una tabla de alineación delrin . La cámara de bioreactor está sentado en la mesa paralela a la mesa de movimiento lineal. Las barras de remolque que se extiende desde la cámara de biorreactor se sujetan a la mesa de un movimiento lineal utilizando un adaptador.
- El paso del motor variador de velocidad (Si el año 2035, productos aplicados en movimiento) se programa mediante el software incluido Si el programador para controlar la manipulación de los soportes de remolque. Tramo axonal se aplica en forma escalonada mediante la adopción de una serie de pasos pequeños desplazamientos separados por tiempos de espera (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Este sistema controlado por computadora ofrece la posibilidad de programar perfiles personalizados para ASG, y es esencial para la experimentación continua durante varios días a la semana.
2. Preparación de biorreactor de Cámara
- Preparar los sustratos cultura desechable de remolque y fijas para el cultivo neuronal:
- Sustratos de la cultura de remolque se cortan de 8.5 "x 11" hojas de película de Aclar (33C 2.0 mil, Structure Probe, West Chester, PA). Usando un cuchillo afilado corte de los sustratos de aproximadamente 0,5 x 2,5 cm, o un poco más corto que el ancho de los carriles para permitir al menos de 1-2mm espacio libre en ambos lados.
- Lije ligeramente la parte inferior 1 / 3 de los sustratos de la cultura de remolque en ambos lados con buen papel de lija de 1200 (McMaster Carr). Lijado de los sustratos de arrastre facilita el crecimiento de los axones de los sustratos de remolque en el sustrato cubreobjetos estacionaria.
- Corte de 5 x 7 cm pedazo de Aclar o utilizar un N º 1 cubreobjetos para servir como sustrato fijo (# 4.865-1, Brain Research Labs, Newton, MA).
- ª limpiasustratos e la cultura con una solución diluida de Alconox y aclare con abundante purificada dH 2 O.
- Esterilizar los sustratos de cultivo por inmersión en etanol al 70% durante 30 minutos. Deje que el sustrato se seque al aire dentro de una campana de cultivo de tejido estéril.
- Limpie la cámara de biorreactor con diluir Alconox y esterilizar en autoclave dentro de un contenedor de autoclave. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, para la transferencia de una campana estéril y dejar secar al aire.
- Continuando dentro de la campana estéril de cola, los sustratos de cultivo para el biorreactor con silicona RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) y algodón estéril hisopos (McMaster Carr):
- Con las patas de bloques de remolque en su posición vertical completa, la cola de los sustratos cultura de remolque a las piernas de bloques de remolque en la parte sin arena. Evite el contacto con la superficie de cultivo con arena.
- Pegue el sustrato de cultivo estacionario en la parte inferior de la cámara del biorreactor.
- Retire el exceso de pegamento y bolsas de aire suavemente presionando un hisopo seco contra los sustratos pegados.
- Desde silicona RTV ácido acético que se filtra es tóxico para las neuronas, el biorreactor se deja secar bajo luz UV dentro de la campana de 2 días completos antes de la introducción de cultivos neuronales.
- Baje las piernas bloque de remolque para lograr un traslape de 2-3mm entre las puntas de los sustratos de arena de remolque y el sustrato fijo. Atención fundamental debe ser pagado con el tamaño de la superposición, si es demasiado grande, las puntas de los sustratos de remolque puede desviar fuera del sustrato fijo, reduciendo el número de axones que se extienden la superposición (figura 3).
- La posición del bloque de remolque en la posición inicial, con las barras de remolque se retractó en el interior del biorreactor. Apriete los tornillos de inmovilización para impedir el movimiento de las barras de remolque antes de estirar el crecimiento.
3. Cultivos neuronales
- 1 ml de la piscina de 10 mg / mL de alto peso molecular de poli-D-lisina (cat # 354210, BD, Bedford, MA) en el medio libre de suero en el área de interfase del sustrato de cada carril. Permita que la solución se adhieren en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague suavemente 3x con dH 2 O, seguido por un enjuague final con los medios de cultivo. Pipeteo debe realizarse en la parte posterior de los carriles, el más alejado de la interfaz de sustrato.
- Aislar los explantes ganglios de la raíz dorsal (GRD) de una rata E16 cachorro. El uso de un microscopio estereoscópico, diluir los explantes en forma de gotas con placas de Petri. Recoger explantes 3-4 con una pipeta 100 L y la placa en el borde del sustrato de cultivo enarenado de remolque. Se debe tener cuidado a la placa de los explantes en el borde del soporte de remolque con un pequeño charco de los medios de comunicación. Hasta 1 ml de medio de cultivo por carril es suficiente para evitar la evaporación durante varias horas, al tiempo que limita el movimiento de los explantes. Formulación de los medios de comunicación: Neurobasal con B-27 + 0,5 mM L-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de SFB-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L de D-glucosa (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/ml NGF (13.290-010, Invitrogen) y M 20 + 20 M FdU inhibidores de la mitosis uridina (F-0503, U-3003, Sigma).
- Coloque la tapa y la transferencia del biorreactor a una incubadora durante 1 hora o hasta que las células se adhieran.
- Llenar el bioreactor con medios de cultivo en el punto más lejano de los explantes para evitar desalojo. Incubar el biorreactor de un mínimo de 5 días, mientras que las neuronas se extienden axones en el sustrato fijo.
4. El crecimiento del axón estiramiento
- El biorreactor se somete a los procedimientos de preparación final dentro de una campana estéril:
- Llenar los embalses en el biorreactor con tampón fosfato salino para humedecer la cámara de evaporación y límite de los medios de cultivo. En nuestro sistema, las paredes del recinto excavado servir como reservorios. Por otra parte, las pequeñas tapas de caja de Petri pueden ser colocados a cada lado del bloque de arrastre sobre los carriles de la cultura.
- Vuelva a colocar los medios de cultivo y llenar las calles de su capacidad. Pipeteo debe realizarse en la parte posterior de los carriles, el más alejado de la interfaz de sustrato.
- El asiento del biorreactor dentro de la tabla de movimiento lineal automatizado. Si el experimento se va a ejecutar dentro de una incubadora, no debe ser humedecido debido a la corrosión potencial de la tabla de movimiento lineal automatizado.
- Fije el adaptador de la barra de remolque a las barras de remolque.
- Si el uso de software programador de correr la etapa de la tabla de movimiento lineal para alinearse con el adaptador de varilla de remolque y fijarlo en el escenario. Para mayor comodidad, preparar secuencias Si programador de antemano con el fin de manipular el escenario en incrementos específicos.
- Afloje los tornillos de inmovilización en la cámara de biorreactor para permitir el movimiento libre del bloque de remolque.
- Estiramiento se aplica en forma escalonada, iniciando una serie de pasos pequeños desplazamientos separados por tiempos de espera (Pfister, Iwata et al. 2006). Nuestro paradigma comienza tomando los pasos 2 m cada 172 segundos,resultando en una red de estiramiento de 1 mm en 24 horas. Después de un día, la velocidad de estiramiento puede ser aumentada mediante el aumento de los desplazamientos o la disminución del tiempo de permanencia (tabla 2).
- Una vez que se inicia la ASG, los cambios en los medios de comunicación no suelen ser necesarios. Con el tiempo, sin embargo, la cultura en general, los medios de comunicación se vuelve ácida y se hace evidente por un cambio de color amarillento. Si se requiere una mayor experimentación, los viejos medios nunca se agote por completo, pero cambió de lugar sólo parcialmente con el fin de minimizar el trauma a los axones flotante.
5. Los resultados representativos:
Axones pueden experimentar un crecimiento tramo muy rápido y robusto. Inicialmente, el proceso se inicia con un período de estiramiento lento (≤ 1mm/day) que consiste en pequeños desplazamientos, poco frecuentes. Dentro de las primeras 24 horas de estiramiento, mecanotransducción de las vías de crecimiento neuronal se produce, según el cual las neuronas comienzan Además de los cilindros del axón. Dentro de las 24 horas de ASG continua, los axones muestran una mayor tolerancia a los desplazamientos mayores y más frecuentes. En general, los axones pueden soportar un aumento en la velocidad de estiramiento de 1mm/day cada 12-24 horas (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). El aumento de la velocidad de estiramiento antes de tiempo, sin embargo, puede conducir a un crecimiento más rápido de los axones de seleccionar, sino que también conducen a la oclusión patológica que causa la desconexión.
Tramo de crecimiento axones tienen la tendencia a formar manojos, se asemeja a la arquitectura de los fascículos. La utilización de los protocolos actuales, la parte central, se extienden crecido de paquetes de axones no tienen adhesiones al sustrato de cultivo. Sólo el principio adherido, los segmentos proximal y distal de los axones se extienden de crecimiento permanecer unidos a los substratos de cultivo. En consecuencia, la parte central del tramo de los axones crecido flotar libremente, y son sensibles a las perturbaciones debidas a la manipulación.
Por una variedad de razones, algunos axones no pueden crecer en la velocidad de estiramiento aplicado. Por ejemplo, una neurona DRG con dos axones, los cuales son sometidos a estiramiento, puede no ser capaz de traducir la suficiente proteína y hacer crecer a la velocidad de estiramiento aplicado. Los axones que no pueden acomodar el estiramiento aplicado delgada siguiente efecto de Poisson. Tramo posterior dará lugar a la oclusión de los axones, la inhibición de la Asamblea, lo que lleva a una desconexión patológica. La mayoría de los axones, sin embargo, son capaces de someterse a ASG con éxito y sólo un pequeño porcentaje de los axones se someten a este proceso de poda similar.
Figura 1. Estiramiento Axon, el crecimiento del sistema de biorreactor. (A) biorreactor de cámara de cultivo y una mesa automatizada de movimiento lineal, (B) Paso del motor variador de velocidad y el software de programación Si.
Figura 2. Cámara de Cultura del biorreactor. Esta caricatura muestra a la cámara de biorreactor de la parte superior con la tapa quitada. La posición del bloque de remolque refleja la etapa final del crecimiento de los axones se extienden. Estire los axones crecido se puede ver en paquetes dentro de los carriles de la cultura.
Figura 3. Sustrato de cultivo de interfaz de Revestimiento. Esta caricatura muestra los componentes del mecanismo de arrastre dentro de cada carril del biorreactor de vista lateral. (Arriba) superposición correcta de los sustratos de la cultura de remolque y parado. (Abajo) una duplicación excesiva de los sustratos de remolque y parado hace que la punta del soporte de remolque para rizar.
Movie 1. Fijación de sustratos de cultivos de biorreactor de la Cámara. Haga clic aquí para ver el video
Movie 2. Revestimiento de DRG explantes sobre sustratos de remolque. Haga clic aquí para ver el video
Movie 3. Uso SiProgrammer. Haga clic aquí para ver el video
Movie 4. Extensión cono de crecimiento sobre el sustrato fijo. Haga clic aquí para ver el video
Película 5. Estirar el crecimiento axonal. Haga clic aquí para ver el video
| Día | Paso |
| 1 | Esterilización y secado |
| 2 | Encolado y la Asamblea |
| 4 | Revestimientos y Revestimiento cultivo neuronal |
| 9 | Tramo de inicio del crecimiento |
Tabla 1. Experimento Lista.
| [Hr] | Velocidad de estiramiento [mm / día] | Tiempo de espera [s] | Longitud total [mm] | Time Stretch total [día] | |
| Pretensión | 24 | 1 | 172.8 | 0 | 1 |
| Tramo | 24 | 1 | 172.8 | 1 | 2 |
| Tramo | 24 | 2 | 86.4 | 3 | 3 |
| Tramo | 24 | 3 | 57.6 | 6 | 4 |
| Tramo | 24 | 4 | 43.2 | 10 | 5 |
| Tramo | 24 | 5 | 34.6 | 15 | 6 |
Tabla 2. Estire Cuadro Tarifario. Todas las medidas se extienden de 2 micras en el desplazamiento (10 pasos motor paso a paso = 2 tramo micras).
Discussion
Dos pasos fundamentales deben ser observadas durante la preparación de los biorreactores. En primer lugar, una superposición óptima en la superficie del sustrato es necesario para asegurar que los axones pueden cruzar sobre el soporte fijo. Aclar que es excesivamente rizado o imperfecta de lo contrario no se debe utilizar (figura 3). Para optimizar la superposición, confirman que el sustrato de remolque es de arena de manera uniforme y en contacto con el sustrato fija de manera uniforme sobre una superficie de contacto de 2-3mm de largo. La coincidencia debe ser optimizado antes de cada experimento con cuidado de ajustar la altura de las piernas de remolque.
En segundo lugar, mientras que proporciona para la conexión de las neuronas, las capas de sustrato mantener considerables fuerzas Sheering causada por el desplazamiento de la tensión de bioreactor y contráctiles de los axones (Heidemann y Buxbaum 1990, Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Sustratos se deben enjuagar bien con agua esterilizada antes y después del recubrimiento de lisina. Recubrimientos se debe aplicar a partir de alícuotas recién descongelado y difundir lo más uniformemente posible. Es importante destacar que los sustratos no debe ser movido o altera de cualquier otra durante el período de adhesión. En pasos posteriores, evitar el contacto con los sustratos en placas, y una pipeta todas las soluciones desde el otro extremo de las calles de distancia de la interfaz de sustrato.
Tolerancias en las conexiones de cada componente biorreactor puede manifestarse en forma de relevo. Durante el período inicial de la ASG, holgura en el sistema es evidente que el movimiento de la tabla de movimiento lineal automático se produce sin el movimiento del bloque de remolque. Holgura puede variar según el experimento, pero es normalmente <1 mm en nuestra experiencia. Por esta razón, una "pre-tensión" fase de eliminación de la holgura 1mm/day, por un día, precede a la ASG horario durante el cual las partes biorreactor participar y comenzar el movimiento de los sustratos de remolque.
Solución de problemas puede ser necesaria si el paso de desplazamiento de la tabla de movimiento lineal automatizado no coincide con el desplazamiento del bloque de remolque después de la fase de pre-tensión se ha completado. Desplazamientos asíncrono, inexacta del bloque de remolque están asociados con "fricción estática" o fricción estática en el hardware de remolque y la flexión del adaptador. Para evitar estos problemas se produzcan, el movimiento del bloque de remolque debe ser revisado por la mano, después del montaje, de suave casi sin esfuerzo el movimiento. Si la vinculación se produce, el conjunto de remolque debe ser liberado antes de la experimentación. Suficiente rigidez del adaptador es necesario para asegurar los desplazamientos precisos, sincrónicos no son superados por la fricción estática de los equipos de remolque.
Disclosures
El alargamiento mecánico ex vivo de células neuronales está patentado bajo las patentes de EE.UU. # 6264944 y # 7429267.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la NSF CARRERA CBET-0747615. Los autores desean agradecer a los Dres. Douglas H. Smith y David F. Meaney por su tutoría y apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD Biosciences | 354210 |
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