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Bioengineering

Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale

doi: 10.3791/2753 Published: August 10, 2011

Summary

Un unico metodo di ingegneria dei tessuti è stato sviluppato per allungare le fibre nervose in coltura da numerosi ricapitolando allungare la crescita degli assoni, una forma di crescita del sistema nervoso per cui i nervi allungare in concomitanza con la crescita del corpo ingrandimento.

Abstract

Durante la pre-sinaptici sviluppo embrionale, i processi neuronali percorrere brevi distanze per raggiungere i loro obiettivi attraverso cono di crescita. Nel corso del tempo, somata neuronali sono separati dai loro terminali degli assoni a causa della crescita scheletrica dell'organismo ingrandimento (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Questo meccanotrasduzione induce una modalità secondaria di crescita neuronale in grado di ospitare continuo allungamento degli assoni (Bray, 1984; Heidemann e Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004)..

La crescita degli assoni Stretch (ASG) è plausibilmente un fattore centrale per la maturazione di processi di breve embrionale nei nervi lungo e tratti di sostanza bianca caratteristica del sistema nervoso adulto. Per studiare ASG in vitro, abbiamo progettato bioreattori per applicare la tensione ai processi brevi assonale di culture neuronali (Loverde, Ozoka et al. 2011). Qui, noi dettaglio i metodi che usiamo per preparare e condurre bioreattori ASG. In primo luogo, all'interno di ogni corsia allungamento del bioreattore, i neuroni sono placcati su uno strato di micro-manipolazione di traino. Successivamente, i neuroni rigenerare i loro processi di assoni, tramite l'estensione del cono di crescita, su un substrato fisso. Infine, la crescita tratto è eseguita da traino i corpi cellulari placcati lontano dai terminali dell'assone aderito al substrato stazionaria; ricapitolando crescita scheletrica dopo l'estensione del cono di crescita.

Il lavoro precedente ha dimostrato che di ASG embrionale neuroni dei gangli spinali di ratto sono in grado di tassi di crescita senza precedenti fino a 10mm/day, raggiungendo lunghezze fino a 10 cm, mentre in concomitanza con conseguente aumento diametro assonale (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Questo è in drammatico contrasto con estensione rigenerativa cono di crescita (in assenza di stimoli meccanici), dove i tassi di crescita medi 1mm/day con rigenerazione successo limitato a lunghezze inferiori a 3 cm (Fu e Gordon 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). Di conseguenza, un ulteriore studio di ASG può aiutare a svelare i meccanismi di crescita sregolata che limitano la rigenerazione, in assenza di stimoli meccanici.

Protocol

1. Panoramica del sistema di bioreattori Stretch Axon crescita

  1. Due approcci predominanti sono stati utilizzati per applicare le forze sperimentale ai neuroni. Nel primo approccio, le forze vengono applicate al neurone intero (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). Nel secondo approccio, le forze vengono applicate direttamente l'assone tirando il cono di crescita. Con aghi di vetro, quest'ultimo approccio è stato utilizzato per la formazione del nuovo modello di assone (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O'Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), individuare soglie vigore per allungamento e retrazione (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992) e di analizzare il clustering neurotrasmettitore nei terminali degli assoni (Siechen, Yang et al 2009).. Un unico estensione ingegneria dei tessuti di questo metodo è stato sviluppato per produrre nervo grande costruisce utilizzando un sistema automatizzato di crescita Stretch Axon (ASG) sistema di bioreattore (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Recentemente, abbiamo sviluppato una versione miniaturizzata del sistema bioreattore per lo studio ASG microscopicamente in tempo reale (Loverde, Ozoka et al. 2011). Qui, dettaglio il protocollo di 9 giorni (tabella 1) attualmente in uso per preparare ed eseguire bioreattori ASG di routine.
  2. Il funzionamento generale: Il sistema bioreattore ASG è costituito da tre componenti principali: 1) una camera bioreattore con corsie indipendenti (allungata pozzi), dove sono coltivate neuroni e allungato, 2) una tabella automatica di movimento lineare di applicare forze stretching e 3) un motore passo passo il controller di unità con il software per controllare la crescita allungare (figura 1).
  3. In breve, la fabbricazione di prototipi bioreattore è stata effettuata in un negozio di macchine utilizzando una macchina fresatrice verticale (Bridgeport, Elmira, NY). Per la biocompatibilità, la facilità di sterilizzazione e la durata, i componenti interni bioreattore sono stati lavorati da 3 / 8 "(PEEK). Trasparente in policarbonato è stato usato per i coperchi per consentire la microscopia ottica e la visualizzazione delle culture. Anticorrosione 316 viti in acciaio inox e hardware completo l'assemblea (McMaster-Carr, Elmhurst, IL).
  4. La camera di bioreattore è composto da una struttura che si forma si estende 3 corsie, un blocco di traino regolabile che manipola le cellule attraverso i vicoli, e sporgenti barre di traino per la manipolazione esterna (figura 2). Culture neuronali sono placcati su supporti cultura usa e getta Aclar traino sostenuto dal blocco di traino (figure 2 e 3). Un substrato coprioggetto usa e getta stazionario si attacca alla parte inferiore del telaio che si estende e si estende su tutte e 3 le corsie. Prima dello stretching, i neuroni placcato deve estendere i processi assonale dal substrato di traino sul substrato fisso tramite l'estensione del cono di crescita. La popolazione di assoni che colmare il substrati successive cui saranno soggetti tratto dallo spostamento controllo del blocco di traino.
  5. La tabella automatizzati movimento lineare è costituito da un motore passo-passo (HT23-397, prodotti di movimento applicata, Watsonville, CA) e la tabella di movimento lineare (MIPS-2-10-1,0 millimetri, servosistemi, Monteville, NJ) montato a una tabella di allineamento in delrin . La camera di bioreattore è seduto nel tavolo parallelo al piano di movimento lineare. Le aste di traino che si estende dalla camera di bioreattore vengono fissati al tavolo movimento lineare utilizzando un adattatore.
  6. La fase di controllo motore (Si 2035, Prodotti movimento Applicata) è programmato utilizzando il software incluso Si programmatore di controllare la manipolazione dei substrati di traino. Allungamento assonale è applicata in maniera graduale facendo una serie di passaggi di piccola cilindrata distanziati da tempi di permanenza (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Questo sistema computerizzato offre la possibilità di programmare profili personalizzati per l'ASG, ed è essenziale per la continua sperimentazione di diversi giorni o settimane.

2. Preparazione del bioreattore Camera

  1. Preparare il substrato della cultura usa e getta di traino e fissi per la cultura neuronale:
    1. Substrati cultura traino sono tagliati da 8,5 "x 11" fogli di pellicola Aclar (33C 2,0 milioni, Sonda Struttura, West Chester, PA). Utilizzando una lama affilata tagliare i supporti a circa 0,5 x 2,5 centimetri, o leggermente inferiore alla larghezza delle corsie per consentire almeno 1-2mm distanza su entrambi i lati.
    2. Carteggiare leggermente inferiore di 1 / 3 ° dei substrati cultura traino sui due lati con belle 1200-grana carta vetrata (McMaster Carr). Levigatura dei substrati traino facilita la crescita degli assoni dai substrati di traino sul substrato coprioggetti fermo.
    3. Tagliare un 5 x 7 centimetri pezzo di Aclar o utilizzare un 1 coprioggetto di vetro No. servire come substrato fisso (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA).
    4. ° puliziasubstrati cultura e con una soluzione diluita Alconox e risciacquare abbondantemente con purificata dH 2 O.
    5. Sterilizzare l'substrati cultura per immersione in etanolo al 70% per 30 minuti. Lasciare i substrati di aria secca all'interno di una cappa sterile coltura di tessuti.
  2. Pulire la camera di bioreattore con diluire Alconox e sterilizzare in autoclave all'interno di un contenitore di autoclave. Immediatamente dopo la sterilizzazione in autoclave, trasferimento in una cappa sterile e lasciare asciugare all'aria.
  3. Proseguendo all'interno della cappa sterile, colla i substrati cultura al bioreattore utilizzando Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) e punta di tamponi di cotone sterile (McMaster Carr):
    1. Con le gambe blocco di traino nella loro posizione verticale pieno, colla i substrati cultura di traino per le gambe blocco di traino nella porzione non levigato. Evitare il contatto con la superficie levigata della cultura.
    2. Incollare il substrato della cultura stazionaria al fondo della camera bioreattore.
    3. Togliere la colla in eccesso e bolle d'aria premendo leggermente un bastoncino asciutto contro i substrati incollati.
    4. Poiché l'acido acetico in silicone RTV liscivie che è tossico per i neuroni, il bioreattore viene lasciato ad asciugare sotto la luce UV all'interno della cappa per 2 giorni interi prima di introdurre le culture neuronali.
  4. Abbassare le gambe blocco di traino per ottenere un 2-3mm sovrapposizione tra le punte delle levigato traino substrati e il substrato fermo. Attenzione cruciali devono essere pagate alla dimensione della sovrapposizione, se è troppo grande, le punte dei substrati trattore possono deviare fuori del substrato fisso, la riduzione del numero di assoni che abbracciano la sovrapposizione (figura 3).
  5. Posizionare il blocco di traino nella posizione di partenza, con le barre di traino retratto all'interno del bioreattore. Serrare le viti di immobilizzazione per evitare il movimento delle barre di traino prima di allungare la crescita.

3. Culture neuronale

  1. 1 ml pool di 10 mg / ml ad alto peso molecolare poli-d-lisina (cat # 354210, BD, Bedford, MA) nel siero-multimediale gratuito presso l'area substrato interfaccia di ogni corsia. Lasciare che la soluzione di aderire indisturbato per 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare delicatamente 3x con dH 2 O, seguita da un risciacquo finale con terreni di coltura. Pipettaggio dovrebbero essere eseguite sul retro delle corsie, più lontano l'interfaccia substrato.
  2. Isolare espianti gangli dorsali (DRG) da un ratto E16 cucciolo. Utilizzando uno stereomicroscopio, diluire il espianti in gocce utilizzando piastre Petri. Raccogliere espianti 3-4 con una pipetta 100 microlitri e la piastra sul bordo del substrato levigato cultura traino. Bisogna fare attenzione al piatto del espianti ai margini del substrato di traino con una piccola pozza di media. Fino a 1 ml di terreni di coltura per corsia è sufficiente per evitare l'evaporazione per diverse ore, limitando il movimento del espianti. Mezzi di formulazione: Neurobasal con B + 0,5 mm-27 L-Glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 G / L di D-glucosio (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) e 20 mM FDU + 20 mM inibitori della mitosi uridina (F-0503, U-3003, Sigma).
  3. Fissare il coperchio e trasferire il bioreattore di un incubatore per 1 ora o fino a quando le cellule aderiscono.
  4. Riempire il bioreattore con terreni di coltura nel punto più lontano della espianti per evitare dislodgment. Incubare il bioreattore per un minimo di 5 giorni mentre i neuroni estendere i processi assonale sul substrato fermo.

4. Axon Stretch crescita

  1. Il bioreattore subisce le procedure di preparazione finale all'interno di una cappa sterile:
    1. Riempire i serbatoi all'interno del bioreattore con tampone fosfato per umidificare la camera di evaporazione e limite dei terreni di coltura. Nel nostro sistema, la cinta muraria scavata fungono da serbatoi. In alternativa, piccoli coperchi capsula di Petri possono essere collocati su entrambi i lati del blocco di traino in cima alla cultura corsie.
    2. Sostituire il mezzo di coltura e riempire le corsie di capacità. Pipettaggio dovrebbero essere eseguite sul retro delle corsie, più lontano l'interfaccia substrato.
  2. Sedile del bioreattore all'interno della tabella automatizzati movimento lineare. Se l'esperimento deve essere eseguito all'interno di un incubatore, non deve essere umidificata per corrosione potenziali del tavolo automatico movimento lineare.
  3. Fissare l'adattatore per asta di traino per le barre di traino.
  4. Utilizzando il software programmatore Si jog la fase della tabella di movimento lineare per allinearsi con l'adattatore per asta di traino e fissarla sul palco. Per comodità, preparare le sequenze Si Programmatore in anticipo al fine di manipolare la scena con incrementi specifici.
  5. Allentare le viti immobilizzazione sulla camera di bioreattore a consentire la libera circolazione del blocco di traino.
  6. Stretch è applicata in maniera graduale iniziando una serie di passi di piccola cilindrata distanziati da tempi di permanenza (Pfister, Iwata et al. 2006). Il nostro paradigma inizia prendendo 2 passi micron ogni 172 secondi,risultante in un tratto netto di 1 millimetro in 24 ore. Dopo un giorno, il tasso di percorso può essere dilagato aumentando o diminuendo lo spostamento del tempo di sosta (tabella 2).
  7. Una volta ASG è avviata, i cambiamenti dei media non sono normalmente richiesti. Nel corso del tempo, però, la cultura dei media in generale si acida ed è evidente da un cambiamento di colore giallastro. Se la sperimentazione è necessaria un'ulteriore, vecchi media non è mai completamente svuotato, ma solo parzialmente modificati per minimizzare il trauma di assoni galleggiante.

5. Rappresentante dei risultati:

Assonale può subire processi di allungare notevolmente la crescita rapida e robusta. Inizialmente, il processo inizia con un periodo di stretching lento (≤ 1mm/day) che consiste di piccoli spostamenti frequenti. Entro le prime 24 ore di stretching, meccanotrasduzione di percorsi di crescita neuronale si verifica, per cui i neuroni cominciano Oltre al cilindro dell'assone. Entro 24 ore dalla ASG continuo, gli assoni mostrano una aumentata tolleranza verso gli spostamenti maggiori e più frequenti. In generale, gli assoni in grado di sopportare un aumento del tasso tratto di 1mm/day ogni 12-24 ore (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). L'aumento del tasso di allungare troppo presto, però, può portare ad una crescita più rapida degli assoni selezionare, ma anche portare ad occlusione patologica che provoca la disconnessione.

Stretch crescita assoni hanno la tendenza a formare fasci, simile all'architettura di fascicoli. Utilizzando protocolli di corrente, la centrale, porzione tratto cresciuta di fasci di assoni non hanno aderenze al substrato culturale. Solo inizialmente aderito, i segmenti prossimale e distale del tratto crescita assoni rimangono attaccati al substrato culturale. Di conseguenza, la parte centrale del tratto assoni cresciuto fluttuare liberamente, e sono sensibili alle interruzioni a causa della manipolazione.

Per una serie di motivi, alcuni assoni non possono crescere al tasso tratto applicata. Ad esempio, un neurone DRG con due processi assonale, che sono entrambi in fase di allungamento, non può essere in grado di tradurre le proteine ​​sufficienti e crescere al ritmo tratto applicata. Assoni che non può ospitare il tratto applicata sarà sottile seguente effetto Poisson. Allungamento successivo porterà alla occlusione degli assoni, montaggio inibendo, con conseguente disconnessione patologico. La maggior parte degli assoni, tuttavia, sono in grado di sottoporsi ASG con successo e solo una piccola percentuale di assoni sottoporsi a questo tipo di potatura processo.

Figura 1
Figura 1. Sistema Stretch Axon crescita bioreattore. (A) Bioreattore camera di cultura e automatizzato tavolo movimento lineare, (B) Fase motore regolatore e Si programmazione software.

Figura 2
Figura 2. Chamber Cultura bioreattore. Questa vignetta raffigura la camera bioreattore dall'alto con il coperchio rimosso. La posizione del blocco di traino riflette lo stadio finale della crescita degli assoni tratto. Tratto assoni cresciuti può essere visto in fasci all'interno della corsia cultura.

Figura 3
Figura 3. Substrato interfaccia Cultura placcatura. Questa vignetta raffigura i componenti del meccanismo di traino all'interno di ogni corsia del bioreattore da vista laterale. (Top) sovrapposizione corretta dei substrati cultura di traino e stazionari. (Basso) sovrapposizione eccessiva dei supporti di traino e stazionaria provoca la punta di un substrato di traino ad arricciarsi.

Movie 1. Attaccamento di supporti Cultura Bioreattore Camera. Clicca qui per guardare il video

Movie 2. Placcatura di DRG Espianti su substrati di traino. Clicca qui per guardare il video

Movie 3. Utilizzo SiProgrammer. Clicca qui per guardare il video

Movie 4. Cono Estensione crescita sul substrato fisso. Clicca qui per guardare il video

Movie 5. Crescita Stretch Axon. Clicca qui per guardare il video

Giorno Passo
1 Sterilizzazione ed asciugatura
2 Incollaggio & Assembly
4 Rivestimenti e placcatura Cultura neuronale
9 Inizio tratto di crescita

Tabella 1. Esperimento Pianificazione.

Tempo [hr] Vota tratto [mm / giorno] Tempo di sosta [s] Lunghezza totale [mm] Time Stretch totale [giorni]
Pretesa 24 1 172,8 0 1
Tratto 24 1 172,8 1 2
Tratto 24 2 86,4 3 3
Tratto 24 3 57,6 6 4
Tratto 24 4 43,2 10 5
Tratto 24 5 34,6 15 6

Tabella 2. Stretch Pianificazione Rate. Tutte le fasi tratto di 2 micron di spostamento (10 punti = 2 motore passo-passo tratto micron).

Discussion

A due passi critici devono essere osservate durante la preparazione di bioreattori. In primo luogo, una sovrapposizione ottimale a livello di interfaccia substrato è necessaria per garantire che gli assoni possono attraversare sul substrato fermo. Aclar che è eccessivamente arricciata o meno imperfetta, non deve essere utilizzato (figura 3). Per ottimizzare la sovrapposizione, verificare che il substrato di traino è levigato in modo uniforme e contatti del supporto fisso in modo uniforme su un 2-3mm superficie di contatto a lungo. La sovrapposizione deve essere ottimizzata prima di ogni esperimento con attenzione regolando l'altezza delle gambe di traino.

In secondo luogo, pur prevedendo l'attaccamento dei neuroni, rivestimenti substrato di sostenere notevoli forze Sheering causato dallo spostamento della tensione bioreattori e contrattile degli assoni (Heidemann e Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Substrati devono essere risciacquati abbondantemente con acqua sterilizzata sia prima che dopo il rivestimento lisina. Rivestimenti devono essere applicati dalle aliquote appena scongelati e ripartite il più omogeneamente possibile. È importante sottolineare che i substrati non deve essere spostato o comunque disturbato durante il periodo di adesione. In passaggi successivi, evitare il contatto con i substrati durante la placcatura, e seminare tutte le soluzioni dal fondo delle corsie di distanza dal substrato interfaccia.

Tolleranze nelle connessioni di ogni componente bioreattore può manifestarsi sotto forma di allentamento. Durante il periodo iniziale di ASG, allentamento del sistema è evidente come il movimento della tavola automatizzati movimento lineare avviene senza il movimento del blocco di traino. Slack può variare per ogni esperimento, ma è tipicamente <1mm nella nostra esperienza. Per questo motivo, un "pre-tensione" fase di eliminazione lasco della 1mm/day, per un giorno, precede il programma di ASG durante il quale le parti bioreattore impegnarsi e iniziare il movimento dei substrati di traino.

Risoluzione dei problemi può essere richiesto se il passaggio spostamento del tavolo automatizzati movimento lineare non corrisponde allo spostamento del blocco di traino dopo la fase di pre-tensione è completa. Asincrona, spostamenti imprecisi del blocco di traino sono associati con 'stiction' o attrito statico all'interno dell'hardware di traino e la flessione della scheda. Per evitare questi problemi si verifichino, il movimento del blocco di traino devono essere controllati a mano, dopo il montaggio, per il liscio quasi senza sforzo il movimento. Se associazione si verifica, l'assemblea di traino deve essere liberato prima della sperimentazione. Una sufficiente rigidità dell'adattatore è necessario anche per assicurare precisione, gli spostamenti non sono sincroni superato stiction dell'hardware traino.

Disclosures

L'ex-vivo allungamento meccanico delle cellule neuronali è brevettato Brevetto US # # 6264944 e 7429267.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF CARRIERA cbet-0747615. Gli autori desiderano ringraziare Drs. Douglas H. Smith e David F. Meaney per il loro mentore e supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PolyEtherEtherKetone (PEEK) McMaster-Carr 8504K69 Custom made bioreactor chamber
Polycarbonate McMaster-Carr 8574K28 Custom made bioreactor chamber lid
Stepper motor Applied Motion Products, Watsonville, CA HT23-397
Linear motion table Servo Systems, Montville, NJ MIPS-2-10-1.0mm
Step motor drive controller Applied Motion Products, Watsonville, CA Si2035
Aclar Structure Probe Inc., West Chester, PA 1859 Towing culture substrates
No. 1 coverslip Brain Research Labs, Newton, MA 4865-1 Stationary culture substrate
Silicon RTV McMaster-Carr 7587A37
Cotton-tipped swabs McMaster-Carr 7074T62
Poly-D-Lysine BD Biosciences 354210

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References

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Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale
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Cite this Article

Loverde, J. R., Tolentino, R. E., Pfister, B. J. Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth. J. Vis. Exp. (54), e2753, doi:10.3791/2753 (2011).More

Loverde, J. R., Tolentino, R. E., Pfister, B. J. Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth. J. Vis. Exp. (54), e2753, doi:10.3791/2753 (2011).

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