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Síntese assistida por microondas, um pote de N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Published: June 28, 2011 doi: 10.3791/2755
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 1,2,3
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles, 2Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles, 3California NanoSystems Institute, University of California at Los Angeles, 4Nuclear Medicine, PET Center, Shanghai Medical Collegea, Fudan University, 5Electronics and Information Engineering, College of Electronics and Information Engineering, Wuhan Textile University
* These authors contributed equally

Summary

A fácil, um pot-síntese da N-succinimidyl-4-[

Abstract

Biomoléculas, incluindo peptídeos, proteínas 09/01, 10,11 e anticorpos e seus fragmentos de engenharia, 12-14 estão ganhando importância tanto como terapêutica em potencial e agentes de imagem molecular. Nomeadamente, quando marcadas com radioisótopos emissores de pósitrons, (por exemplo, Cu-64, Ga-68 ou F-18), eles podem ser usados ​​como sondas para a imagem latente alvo de muitos processos fisiológicos e patológicos. 15-18 Portanto, esforço significativo tem dedicada à síntese e exploração de 18 F-rotulados biomoléculas. Embora haja exemplos elegante dos 18 F-rotulagem direta de peptídeos, 19-22 condições de reação dura (ou seja, orgânica pH, solvente extrema, alta temperatura) associado com radiofluorination diretos são geralmente incompatíveis com amostras de proteínas frágil. Até o momento, portanto, a incorporação do fármaco grupos prostéticos em biomoléculas continua sendo o método de escolha 23,24.

N-Succinimidyl-4-[18 F] fluorobenzoate ([18 F] SFB), 25-37 um reagente tipo Bolton-Hunter que reage com os grupos amino primários de biomoléculas, é um muito versátil grupo prostético para os 18 F-rotulagem de um amplo espectro de entidades biológicas, em termos de sua evidente estabilidade in vivo e rendimento de radiomarcação alta. Após a marcação com [18 F] SFB, o que resulta [18 F] biomoléculas fluorobenzoylated poderiam ser exploradas como marcadores PET potencial para estudos in vivo de imagens. Most 1 [18 F] radiosyntheses SFB descrito nas literaturas atuais requerem dois ou até três reatores e purificações múltiplas usando extração em fase sólida (SPE) ou cromatografia líquida (HPLC). Tais processos longos dificultam a sua produção de rotina e aplicações difundidas na marcação radioactiva de biomoléculas. Apesar de vários módulo assistida [18 F] sínteses SFB foram relatados, 29-32, 41-42 são baseados principalmente em procedimentos complicados e demorados utilizando caro caixas disponíveis comercialmente radioquímica (Tabela 1). Portanto, uma maior simplificação do radiosynthesis de [18 F] SFB utilizando uma configuração de baixo custo seria muito benéfico para a sua adaptação a um processo automatizado.

Relata-se uma preparação concisa de [18 F] SFB, com base em uma versão simplificada um pot-síntese assistida por microondas, (Figura 1). A nossa abordagem não exige purificação entre as etapas ou qualquer reagentes aquosos. Além disso, a irradiação de microondas, que tem sido usado na síntese de vários marcadores PET, 38-41 pode dá RCYs maior e melhor seletividade do que as reações correspondentes térmica ou eles fornecem rendimentos semelhantes em tempos de reação mais curtos. 38 Mais importante, quando rotulagem biomoléculas , o tempo economizado poderia ser desviado para bioconjugation subseqüente ou passo de imagem PET 28,43 novidade de nosso melhor [18 F] síntese SFB é duplo: (1). estratégia desproteção anidro não requer purificação dos intermediários (s) entre cada etapa e (2) o forno de microondas, transformações radioquímica permitir a produção rápida e confiável de [18 F] SFB.

Protocol

1. Preparativos iniciais

  1. Um frasco de V-(5-mL) RV1 (com agitação bar) é usado como vaso de reação principal para a realização de síntese de microondas. Ele é conectado a um adaptador de PEEK com sete entrada / saída portas conecta e colocado dentro da cavidade de microondas (ver figura 2). RV2 está ligado ao cartucho de SPE (I) para recolher o crude [18 F] SFB. RV3 está ligado ao cartucho de SPE (II) para coletar o final [18 F] solução SFB. Ele pode ser colocado em um banho de água quente (40 ° C) para concentrar a solução correspondente antes de reconstituir em tampão PBS, especialmente para a radiomarcação a jusante de biomoléculas.
  2. Configuração para a recolha de crude [18 F] SFB: Encha MeCN / H 2 O [6 mL; 1:4 (v: v)] solução, 5% ácido acético aquoso (8 mL), MeCN (2 mL) para reservatório A, B e C, respectivamente. Em seguida, ativar um cartucho de SPE (I) (poliestireno, Merck LiCholut PT) com etanol (10 mL), seguido por 5% ácido acético aquoso de lavar (10 mL).
  3. Configuração para a coleta purificada [18 F] SFB: Prepare reservatório D e E preenchida com 10 ml de H 2 O e 3 ml de éter etílico, respectivamente. O segundo cartucho de SPE (II) (poliestireno, Merck LiCholut PT) é ativado pelo mesmo procedimento mencionado acima.
  4. Iniciar o HPLC (eluição buffer: MeCN / H 2 O, 1:1 (v / v) contendo 0,2% TFA; taxa de fluxo: 3 ml / min) para o condicionamento pré-coluna HPLC [a coluna em fase reversa semi-prep (Luna, 5 mm C18 (2) 100 A, 250 x 10 mm), Phenomenex, Torrance, CA, EUA].

2. Preparação de secas [isto é, não portadora agregado, (NCA)] [18 F] flúor

  1. [18 F] flúor na solução [18 O] H 2 O (100 mL) foi adicionado a uma mistura de Kryptofix 222 (20 mg), 1M aquoso K 2 CO 3 (26 mL) e MeCN (0,8 mL) em um Eppendorf tubo. Toda a solução é então misturado bem antes de transferir para a via de entrada de linha RV1 1. [18 F] flúor solução também pode ser passado através de um cartucho de troca aniônica (por exemplo, QMA-light Sep-Pak de Águas) para prender o flúor-18 e, em seguida eluído com uma mistura de K 2 CO 3 e Kryptofix em MeCN.
  2. Executar a seqüência de secagem (20W, 3 min), sob o programa de controle de microondas para remover a água residual em RV1 [no vácuo]. Após o resfriamento a temperatura do sistema está abaixo de 50 ° C, MeCN adicionais (1,0 mL) foi introduzido no reator ea seqüência é repetida uma vez.

3. Síntese de etil 4 - [18 F] fluorobenzoate

  1. Para uma solução de DMSO (0,4 mL) contendo etil 4 - (N, N, N-trimetilamônio) benzoato triflate (1,5 mg) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 2.
  2. Execute a seqüência de Etiquetagem (50W, 1 min) no âmbito do programa de controle de microondas com refrigeração navio mexendo, e todas as válvulas fechadas para pagar etílico 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2).

4. Síntese de 4 de potássio - [18 F] fluorobenzoate

  1. Para uma solução de DMSO (0,5 mL) contendo KOtBu (13 mg) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 3.
  2. Executar o programa desproteger (40 W, 1 min) no âmbito do programa de controle de microondas com refrigeração navio mexendo, e todas as válvulas fechadas para arcar com o 4 - [18 F] fluorobenzoate sal ([18 F] 3).

5. Síntese de crude [18 F] SFB

  1. Para uma solução de acetonitrila (2,5 mL) contendo TSTU (30 mg) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 6. TSTU é a umidade e sensível à luz. Deve ser aliquotado em pequeno frasco e armazenados a 4 ° C em um recipiente fechado, cobertas por folhas de alumínio.
  2. Execute seqüência de acoplamento (30W, 2 min), sob o programa de controle de Microondas com refrigeração navio mexendo, e todas as válvulas fechadas para pagar o crude [18 F] SFB.

6. A Preparação do SPE-purificada [18 F] SFB

  1. 5% ácido acético aquoso (1,0 mL) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 7 para neutralizar a mistura de reação. A solução foi então transferida para B frasco contendo 8 ml de ácido acético 5% aquoso (Figura 2).
  2. Passe a mistura de reação diluída através de cartucho de SPE (I) para prender crude [18 F] SFB utilizando nitrogênio (10 psi).
  3. WASH SPE cartucho (I) com uma mistura de MeCN e H 2 O [10 mL, 1:4 (v: v)] do reservatório A.
  4. [18 F] SFB foi eluída fora em RV2 usando MeCN (2 mL) do reservatório C.

7. Purificação do bruto [18 F] SFB com a Rádio-HPLC

  1. Diluir ou crude [18 F] SFB ou SPE-purificada [18 F] SFB com H 2 O (2 mL) em RV2 e transferir a mistura para o loop HPLC (5 mL). A solução foi injetado o rádio-HPLC [MeCN / H 2 O, 1:1 (v / v) contendo 0,2% TFA; taxa de fluxo: 3 mL / min].
  2. Recolher a fração purificada contendo [18 F] SFB (retenção time: 8-10 minutos) no frasco D (pré-cheias com 10 ml de H 2 O) (Figura 2). Etapa crítica: Se realizado corretamente, o volume de fracção recolhida, aqui deve ser ml 4-5.
  3. Passe a mistura de reação diluída através de cartucho de SPE (II) para prender purificada [18 F] SFB utilizando nitrogênio (10 psi). Seque o cartucho com uma corrente de azoto por 2-3 minutos.
  4. [18 F] SFB foi eluída com éter dietílico em RV3 usando (3 mL) do reservatório E..
  5. Evaporar o solvente em RV3 à secura por um fluxo suave de gás nitrogênio (10 psi), utilizando um banho de água (40 ° C). A seca final [18 F] SFB pode ser reconstituído em tampão PBS para a aplicação a jusante.

8. Resultados representativos:

Nós desenvolvemos uma versão simplificada, rápida, um pot-método para a síntese de [18 F] SFB utilizando uma estratégia de desproteção em condições anidro e aquecimento por microondas durante cada transformação radioquímica / química. A Figura 1 apresenta os detalhes de nossa radiosynthesis. A identidade do produto final foi confirmado pela comparação de HPLC tempo de retenção com uma referência SFB não-radioativo. A purificada [18 F] SFB também foi analisada por meio de rádio-TLC e-HPLC para determinar a sua pureza radioquímica e química. O RCY de [18 F] SFB foi de 35 ± 5% em 60 min após HPLC purificação (n> 30), com alta pureza radioquímica (> 99%) e pureza química boa (veja o traço UV no perfil HPLC, a Figura 3 ). A atividade específica foi ca. 67-330 GBq / mmol (1,8-9,0 Ci / mmol), dependendo da radioatividade de partida.

Figura 1
Figura 1. Microondas assistida radiosynthesis um pot-de [18 F] SFB. Primeiro, o radiofluorination de etil 4 - (N, N, N-trimetilamônio) benzoato triflate (1) foi realizada sob aquecimento por microondas (50 W, 1 min) na presença de [K ⊃ 2.2.2] [18 F] F - complexos em dimetilsulfóxido (DMSO) para pagar etílico 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). Sem purificação, uma solução de DMSO de potássio terc-butóxido (t BuOK) foi adicionado ea reação foi navio de microondas irradiada (40 W, 1 min) para concluir a desproteção anidro. A conversão final do [18 F] 3 em [18 F] SFB foi realizada com O-(N-succinimidyl) - N, N, N ', N' tetramethyluronium-tetrafluorborato ativação (TSTU). TSTU em acetonitrila foi adicionado à mistura de reação contendo o 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 3) de sal; esta última etapa sintética rendeu bruto [18 F] SFB após o aquecimento (30 W, 2 min).

Figura 2
Figura 2. O esquema de instalação para forno de microondas, um pot-[18 F] síntese SFB.

Figura 3
Figura 3. Radio-HPL cromatogramas da final [18 F] SFB. Top: sinal de UV a 254 nm; inferior: sinal radioativo; inset: UV sinal em 254 nm (33,3 x).

Tabela 1
. Tabela 1 Resumo da [18 F] radiosyntheses SFB relatados na literatura usando alquila 4 - (trimetilamônio) triflate benzoato como precursores.

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Discussion

Este simplificado de três etapas, um pot-radiosynthesis dos 18 reagente F-acilação [18 F] SFB é desenvolvido com base em não-aquosos química. Este processo tem excelente reprodutibilidade e pode ser usado de forma confiável para a produção de [18 F] SFB em módulos radioquímica automatizada, devido a duas modificações-chave descritas como seguintes: 1. Nós empregamos um passo desproteção / saponificação no sistema KOtBu / DMSO anidro para substituir a solução aquosa de base comuns ou ácidos. Nossa estratégia de desproteção não aquoso permite adição sequencial de reagentes sem purificação SPE intermediário ou solvente de evaporação / troca. Esta modificação elimina a necessidade de um número significativo de componentes extras e unidades de controle associado com um segundo reator e módulos SPE que foram exigidos em outras rotas sintéticas. Portanto, reduz a complexidade do sistema, aumentando a sua confiabilidade. Nosso processo pode ser realizado em uma configuração manual simples ou em um módulo radioquímica automatizado possuindo uma única configuração de reator básica. Além disso, a eliminação de purificação SPE (s) entre as etapas encurta o tempo de síntese total. 2. O uso de aquecimento por microondas também permite a produção rápida e confiável de [18 F] SFB (ver Tabela 1 para comparação com outros métodos). Nós aplicamos microondas em cada passo durante este um pot-[18 F] SFB síntese: F-18 a secagem, radiofluorination, desproteção e ativação. Como indicado na figura 1, cada transformação foi completa dentro de 1-2 min sob aquecimento por microondas, em comparação, que geralmente requer 5 - 10 minutos, quando com aquecimento de condução convencionais (por exemplo, banho de óleo ou bloco aquecedor) 29-32, 41 -. 42

Com uma redução significativa em sua complexidade global, acreditamos que esta síntese melhorada e concisa fará a produção rotineira de [18 F] SFB mais prático e atraente para adopção em módulos automatizados, permitindo a utilização de 18 F-43 biomoléculas rotulados como pesquisa ferramentas para acelerar a descoberta biomédica e aprimorar os estudos clínicos.

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Disclosures

Este método tem sido submetido a EUA pedido de patente.

Acknowledgments

Este estudo foi financiado pelo Departamento de Energia dos EUA (DE-FG02-09ER09-08 e DE-PS02-09ER09-18), a Jonsson Comprehensive Cancer Center da UCLA, e da Indústria-Universidade Programa Cooperativo de Pesquisa (UC Discovery Grant, bio07 -10665). Agradecemos ao Dr. Nagichettiar Satyamurthy e equipes no Centro de UCLA Cyclotron Biomédica para fornecer o F-18 radioisótopos e discussões perspicaz muitos. Agradecemos a drs. Michael Collins, Greg Leblanc, Joseph Lambert, e Keller Barnhardt de CEM para os seus conselhos e apoio técnico. Agradecemos a Dirk Williams, Darin Williams, os drs. Joseph Lin Hong Dun, e Michael van Dam para peças de design e de usinagem para modificar o reator de microondas CEM e para os módulos de purificação SPE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetic acid in aqueous solution (5%, v/v) Fisher Scientific A38-500 Prepared in our lab
Acetonitrile Sigma-Aldrich 75-05-8
Diethyl ether Sigma-Aldrich 14775
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301
Ethyl 4-(N,N,N-trimethylammonium) benzoate triflate Prepared in Lab
4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane (K222) Sigma-Aldrich 29,111-0
O-(N-succinimidyl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) Sigma-Aldrich 105832-38-0
Potassium carbonate in aqueous solution (1M) Sigma-Aldrich 209619 Prepared in our lab
Potassium tert-butoxide Sigma-Aldrich 156671

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologia Molecular Edição 52 radiomarcação microondas radioquímica flúor-18 um pot-síntese [18F] SFB
Síntese assistida por microondas, um pote de<em> N</em>-Succinimidyl-4-[<sup> 18</sup> F] fluorobenzoate ([<sup> 18</sup> F] SFB)
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Hou, S., Phung, D. L., Lin, W.,… More

Hou, S., Phung, D. L., Lin, W., Wang, M., Liu, K., Shen, C. K. Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB). J. Vis. Exp. (52), e2755, doi:10.3791/2755 (2011).

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