Summary
我々はビデオで腔内モノフィラメントを使用して成体マウスの中大脳動脈閉塞を製造する方法を示しています。我々はまた、2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）染色による脳梗塞の程度を評価する方法を示します。
Abstract
脳卒中は米国1の最も一般的な致命的な神経疾患です。脳の血管の閉塞（虚血性脳卒中）2からのストロークの大多数（88％）の結果。ほとんどの虚血性脳卒中（〜80％）中大脳動脈（MCA）の3地域で行われるため、開発されている多くの動物ストロークモデルは、この動脈に焦点を当てている。中大脳動脈閉塞（MCAO）の管腔内モノフィラメントモデルは、外頸動脈に外科的にフィラメントの挿入と先端がMCAの起源を閉塞するまで停止の結果、内頸動脈（ICA）に前方にスレッドを含む血流とMCA領域4のその後の脳梗塞の。手法は永続的または一時的な閉塞5をモデル化するために使用することができます。縫合糸は、一定のインターバル後に削除されている場合（30分、1時間、または2時間）、再灌流が（一時的なMCAO）が達成され、フィラメントはその場に放置されている場合（24時間）の手順では、恒久的なMCAOのモデルとして適しています。 。このテクニックはクレイニエクトミ、頭蓋内圧と温度6に影響を与える可能性のある頭蓋骨の一部を、削除するには、脳外科的処置を必要としません。それは、ラットやマウス7,8の永久および一時的な局所脳虚血を模倣するために最も頻繁に使用される方法となっている。脳梗塞の程度を評価するために、我々は、虚血脳組織9を識別するために、2,3,5 -塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）での脳切片を染色。このビデオでは、我々はMCAO法およびTTC染色により梗塞サイズの測定を示しています。
Protocol
1。 MCAO方法
このプロトコルは、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所で動物実験によって承認され、UCSFとケント州立大学で委員会を使用して、遵守された。
- 20mmのセグメントに5から0モノフィラメント縫合糸（ハーバード装置、ホリストン、MA）をカット。 cauterizer（ブレーントリーサイエンティフィック社、ブレーンツリー、MA）の近くに加熱することにより、各セグメントの先端を丸める。マイクロメートル（応用イメージ社、ロチェスター、NY）を用いて先端の直径を測定する。我々は25-30 gの体重を持つマウスのために0.21〜0.22ミリメートルの最後の先端径との縫合糸を使用してください
- オートクレーブ（最小121 ° C、15 PSI、15分間）により、すべての手術器具を滅菌する。 70％エタノールを使用して手術のテーブルおよび関連機器をサニタイズ。
- V - 10麻酔システムを使用して、OはO 2 / 70％N 2 30％のイソフルラン5％8月12日週齢のマウス（25〜30グラム）（Aerrane、バクスター、ディアフィールド、イリノイ州）の麻酔（VetEquip株式会社。、プレザントン、カリフォルニア州）。麻酔の誘導後、イソフルランのレベルを低下させ、1.5％で、それを維持する。
- 加熱パッド上に仰臥位にマウスを置きます。直腸プローブを挿入し、℃、TR - 200恒温温度システム（ファイン科学ツール（株）、フォスターシティー、CA）を使用して36.5から37.5の間に体温を監視し、維持する。
- 肌を露出するために電気バリカン（ブレーントリーの科学）と頸部腹側の領域の上に毛皮を剃る。 70％エタノールつのアプリケーションを使用して手術部位を消毒する。
- ステレオ解剖顕微鏡下で（ニコン、日本）、首に1センチの正中切開を行います。手術野を公開し、右総頸動脈（CCA）、外頸動脈（ECA）、および内頸動脈（ICA）を識別するために、リトラクター（ブレーントリーサイエンティフィック）を使用してください。慎重に神経や筋膜の周囲から無料の動脈を詳細に分析します。
- さらに遠位にECAを摘出し、バイポーラ凝固剤（ハワードインストゥルメント社、アラバマ州タスカルーサ）を使用してECAとその上甲状腺動脈（STA）分岐を凝固。凝固したセグメントでECAとSTAをカット。
- 大まかにECAの切り株2箇所を8から0絹縫合糸を結ぶ。 ECAとICAにCCAの分岐部に血管クランプ（ファイン科学のツール）を適用します。
- Vannas -スタイル春のはさみ（ファイン科学のツール）とECA切り株の端の小さな切開を加えます。先端に丸みを帯びた5から0モノフィラメント縫合糸の長さを測定し記録する。切開に縫合を挿入し、クランプに進みます。だけで十分な確保はまだで、住居のモノフィラメント縫合糸の機動性を維持するために内腔2箇所を絹の縫合糸を締めます。
- 分岐からクランプを外します。ゆっくりとMCAの起源を閉塞するためにCCAの分岐を超えて9〜10ミリメートルの距離にICAにECAの内腔からモノフィラメント縫合糸を進める。手術時間は約30-45分です。
- 首に切開を縫合し、麻酔からの回復、そしてケージに戻すために35 ° C看護のボックスにマウスを置きます。それは一般的に麻酔から回復するためにマウスの5〜10分かかります。過渡MCAOを実行するには、研究者は、通常の間に0.5〜2時間をマウスを再度麻酔し、一定期間後にECAの切り株に戻って縫合を撤回することができます
- MCAOの誘導24時間後には、イソフルラン5％、マウスを麻酔し、頚椎脱臼によってそれを安楽死させる。マウスの首を切ると脳を収集する。氷の上で脳の行列（ブレーントリーサイエンティフィック）を持つ4 2mmのスライスにcoronally脳をスライスして。梗塞の大きさと範囲を決定するために室温で20分間、1 × PBS中の2％2,3,5 - トリフェニル塩化（TTC）（Sigma - Aldrich社）での脳切片をインキュベートします。イメージングまで中立を4でホルマリン溶液を（Sigma - Aldrich）をバッファリング10％の脳のスライス° Cを修正。 Joveのプロトコル955（で説明されているように心筋梗塞の程度を定量化することができるhttp://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ）9。
2。代表的な結果
MCAOによって生成された梗塞は、線条体と背外側皮質に見られる。線条体は大脳皮質よりも虚血の影響を受けやすくなります。 MCAOの一時間以上は、線条体と皮質の両方を損傷する恐れながら、MCAOの30分は、唯一の線条体の梗塞が生成されます。 24時間永久MCAO後、合計梗塞の割合は、±半球の5％〜40であり、手術後の死亡率は約10％です。過度の出血が手術中に発生した場合、我々はさらに研究からマウスを除外する、操作時間が90分を超えると、マウスは15分以内に麻酔からの回復に失敗する、または出血は、脳のスライスにまたは剖検時にウィリス動脈輪の根元に発見され。
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永久MCAOの24時間後のTTC染色した脳切片の図1。代表画像（コロナルレベル1-4）。壊死領域でそのような酵素活性の欠如に起因する白のまま組織TTCを生体内で酵素的に色が赤になっている1,3,5 - triphenylformazan（TPF）、、にデヒドロゲナーゼによって低減されます。そのため、梗塞の領域はTPFへのTTCの変換が不足しているため、その白い色で識別することができます。注：これは可能な限り熱と光から染色した切片を保護TTCが不安定にやや熱と光です。
Discussion
マウスのMCAOは一般にヒトで局所性脳虚血をモデル化するために使用されます。脳卒中の研究のためのマウスの使用は、トランスジェニックやノックアウト株の可用性をより頻繁になっています。プロトコルで注意するいくつかの重要な詳細があります。
- それは手術中にマウスの体温を維持するために不可欠であり、それは完全に麻酔から回復する前に。体温は、梗塞の程度に影響があり、低体温が低下し、温熱療法は、梗塞のサイズが大きくなります。
- 公開し、CCAとECAを隔離し、梗塞サイズと減少生存率を増加させることができる近くの迷走神経や気管を、損傷を避ける。
- 10mm以上の分岐を通過モノフィラメント縫合糸を挿入しないでください。遠く挿入縫合糸は、脳内出血で前大脳動脈とその結果を穿孔することができます。縫合糸は、分岐点を超えて9〜10ミリメートル程度進んでいるときに抵抗が感じられる。この問題が発生した場合、研究者は、縫合糸を進める停止し、距離を確認する必要があります。
Disclosures
我々は、開示する潜在的な利害対立を持っていない。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金NS057195、UCSF REAC賞、そしてケント州立大学のスタートアップ資金WHチョウにによってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Chemical | Baxter Internationl Inc. | 95045-588 | |
| V-10 Anesthesia system | Equipment | VetEquip | 901807 | |
| TR-200 Temp Controller | Equipment | Fine Science Tools | 21060 | |
| Electric clipper | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | CLP-9931 | |
| Dissecting microscope | Equipment | Nikon Instruments | SMZ745T | |
| Retractor system | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | ACD-014 | |
| Bipolar coagulator | Equipment | Howard Instrument | 64000 | |
| Silk suture | Material | Harvard Apparatus | 510479 | |
| Monofilament suture | Material | Harvard Apparatus | 723351 | |
| Vascular clamp | Equipment | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Vannas scissor | Equipment | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Brain matrix | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | BS-2000C | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Chemical | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 10% neutral buffer formalin | Chemical | Sigma-Aldrich | HT5011 |
References
- Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
- Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
- Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
- Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).
