Summary
Мы демонстрируем в видео способе получения окклюзии средней мозговой артерии у взрослых мышей использования внутрипросветного мононити. Мы также показываем, как оценить степень инфаркт мозга по 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (ТТК) окрашивания.
Abstract
Инсульт является наиболее распространенным фатальной неврологической болезни в США 1. Большинство ударов (88%) в результате блокирования сосудов головного мозга (ишемический инсульт) 2. Так как большинство ишемических инсультов (~ 80%) имеют место на территории средней мозговой артерии (СМА) 3, многих животных инсульта моделей, которые были разработаны сосредоточили свое внимание на этой артерии. Внутрипросветный модель мононити средней мозговой артерии (MCAO) включает вставки из хирургической нити в наружной сонной артерии и резьбы его вперед на внутренней сонной артерии (ВСА) до кончика закрывает происхождения MCA, что приводит к прекращению кровотока и последующего инфаркта мозга в 4 территории MCA. Метод может быть использован для моделирования постоянной или транзиторной окклюзии 5. Если шов удаляется через определенный интервал (30 мин, 1 час, или 2 ч), реперфузия достигается (переходные MCAO), если нить остается на месте (24 ч) процедура может быть использован как модель непрерывного MCAO . Этот метод не требует удаление фрагментов костей черепа, нейрохирургические процедуры для удаления части черепа, которые могут повлиять на внутричерепное давление и температура 6. Она стала наиболее часто используемый метод, чтобы имитировать постоянное и временное координационного ишемии головного мозга у крыс и мышей 7,8. Для оценки степени инфаркт мозга, мы пятна мозга ломтики с 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид (ТТС) для выявления ишемической ткани мозга 9. В этом видео, мы демонстрируем MCAO метод и определение размера инфаркта окрашиванием ТТК.
Protocol
1. Метод MCAO
Этот протокол был одобрен Уходу за животными и использование комитетов UCSF и Кентского государственного университета, а также соблюдает Национального института здоровья руководящих принципов для использования подопытных животных.
- Вырезать 5-0 мононити шва (Harvard Аппарат, Холлистон, М. А.) в 20 мм сегменты. Круглый кончик каждого сегмента при нагревании его рядом cauterizer (Braintree Научные, Inc, Braintree, MA). Измерьте диаметр кончика использованием микрометра (Applied изображения Inc, Рочестер, штат Нью-Йорк). Мы используем шва с конечным диаметром кончика 0.21-0.22 мм для мыши с массой тела 25-30 г.
- Стерилизовать всех хирургических инструментов в автоклаве (минимум 121 ° С, 15 PSI, в течение 15 мин). Sanitize таблице хирургии и связанного с ним оборудования с использованием 70% этанола.
- Обезболить 8-12 недельных мышей (25-30 г) с 5% изофлуран (Aerrane, Baxter, Дирфилд, штат Иллинойс) в 30% O 2 / 70% N 2 O использованием V-10 Анестезия системы (VetEquip, Inc ., Плезантон, Калифорния). После вводного наркоза, снижение уровня изофлуран и поддерживать его на уровне 1,5%.
- Наведите в положении лежа на грелку. Вставьте ректального датчика, а также контролировать и поддерживать температуру тела между 36.5-37.5 ° С с использованием TR-200 теплокровных температуры системы (Fine науки Инструменты Inc, Foster City, CA).
- Бритье мех на вентральной области шеи с электрическими ножницами (Braintree Scientific) подвергать кожу. Лечить хирургического сайте, используя три заявки из 70% этанола.
- Под стерео рассекает микроскоп (Nikon, Япония), чтобы 1 см в длину средней линии разрез на шее. Используйте преднатяжителями (Braintree Scientific) подвергать операционного поля и определить правой общей сонной артерии (ССА), внешние сонной артерии (ЭКА), и внутренней сонной артерии (ВСА). Аккуратно вскрыть артерии свободными от окружающих нервов и фасции.
- Рассеките ЭКА дальнейшего дистально и коагулируют ЭКА и ее превосходной артерии щитовидной железы (STA) филиала использованием биполярного коагулятора (Howard Инструмент Inc, Tuscaloosa, AL). Вырезать ЭКА и ГНА в коагулируют сегменте.
- Свободно два галстука 8-0 швов шелка вокруг культи ЕЦА. Применить сосудистой зажим (Fine Инструменты наук) в бифуркации ОСА в ЭКА и ICA.
- Сделайте небольшой надрез в конце ЭКА пень с Vannas стиле весны ножницы (Fine Инструменты наук). Измерьте и запишите длину 5-0 мононити шва закругленным кончиком. Вставьте шва в разрез и заранее, чтобы зажим. Затяните два шелковых швов вокруг просвета просто достаточно, чтобы обеспечить еще сохранить подвижность в жилых мононити шва.
- Снимите зажим бифуркации. Аккуратно заранее мононити шва из просвета ЭКА в МКА на расстоянии 9-10 мм за бифуркации ОСА окклюдировать происхождения MCA. Длительность операции составляет около 30-45 мин.
- Шовный разрез на шее и место мышь в 35 ° C кормящих поле, чтобы оправиться от наркоза, и вернуть ее в клетку. Как правило, он занимает 5-10 мин для мышей, чтобы оправиться от наркоза. Для выполнения переходных MCAO, исследователь может повторно анестезию мыши и снять шов обратно в культю ЭКА после периода времени, обычно от 0,5-2 ч.
- Двадцать четыре часа после индукции MCAO, обезболить мышь с 5% изофлуран и усыпить его, шейки дислокации. Обезглавьте мыши и собирать мозга. Нарежьте мозга коронки на четыре 2-мм кубиков с матрицей мозга (Braintree Scientific) на льду. Инкубируйте мозга ломтики в 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид (ТТС) (Sigma-Aldrich) в 1X PBS в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы определить размер и степень миокарда. Fix мозга срезов в 10% нейтральный буферный формалин решение (Sigma-Aldrich) при 4 ° С до визуализации. Степень миокарда может быть определена количественно, как описано в протоколе Юпитера 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9.
2. Представитель Результаты
Инфаркты порожденных MCAO видны в полосатом теле и дорсолатеральной коры головного мозга. Полосатого тела более чувствительна к ишемии, чем коры головного мозга. Тридцать минут MCAO будет производить инфаркта только в полосатом теле, а более одного часа MCAO может повредить как стриатуме и коре головного мозга. Через 24 ч постоянной MCAO, общий процент инфаркта ~ 40 ± 5% от полушарии и смертности после операции составляет ~ 10%. Мы исключаем мышей от дальнейших исследований, если чрезмерное кровотечение во время операции, время работы превышает 90 мин, мыши не могут оправиться от наркоза в течение 15 мин, или кровотечение в мозгу ломтиками или у основания круг Уиллис во вскрытии .
61/2761fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Представителю образы TTC-окрашенных ломтики мозга (корональные уровня 1-4) после 24 часов постоянного MCAO. В живой ткани TTC ферментативно сократилось на дегидрогеназ с 1,3,5-triphenylformazan (ВПС), который является красный цвет, а в некротических областях она остается белым из-за отсутствия такого ферментативную активность. Таким образом, область миокарда можно определить по его белым цветом из-за отсутствия преобразования TTC в ВПС. Примечание: TTC несколько тепла и света, поэтому нестабильный защитить окрашенные срезы от тепла и света как можно больше.
Discussion
MCAO у мышей обычно используется для модели фокальной ишемии мозга у людей. Использование мыши для хода исследования стало более частым из-за наличия трансгенных и нокаут штаммов. Есть несколько ответственных деталей отметить в протоколе:
- Это необходимо для поддержания температуры тела мыши во время операции и, прежде чем она полностью оправится от анестезии. Температура тела оказывает влияние на степень миокарда; переохлаждение уменьшается, а гипертермия увеличивает размер инфаркта.
- Хотя разоблачение и изоляцию ОСО и ЭКА, избежать повреждения близлежащих блуждающего нерва и трахеи, что может увеличить размер инфаркта и снижению жизнеспособности.
- Никогда не вставляйте мононити шва более 10 мм проходит бифуркации. Шов вставлен слишком далеко может перфорировать передней мозговой артерии и в результате кровоизлияния в мозг. Сопротивление может быть чувствовал, когда шов передовых около 9-10 мм за точкой бифуркации. В этом случае исследователь должен остановить продвижение шва и подтвердить расстояния.
Disclosures
У нас нет любые потенциальные конфликтующие интересы раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант NS057195, UCSF REAC награду, и Kent State University запуска фонда WH Чжоу.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Chemical | Baxter Internationl Inc. | 95045-588 | |
| V-10 Anesthesia system | Equipment | VetEquip | 901807 | |
| TR-200 Temp Controller | Equipment | Fine Science Tools | 21060 | |
| Electric clipper | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | CLP-9931 | |
| Dissecting microscope | Equipment | Nikon Instruments | SMZ745T | |
| Retractor system | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | ACD-014 | |
| Bipolar coagulator | Equipment | Howard Instrument | 64000 | |
| Silk suture | Material | Harvard Apparatus | 510479 | |
| Monofilament suture | Material | Harvard Apparatus | 723351 | |
| Vascular clamp | Equipment | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Vannas scissor | Equipment | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Brain matrix | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | BS-2000C | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Chemical | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 10% neutral buffer formalin | Chemical | Sigma-Aldrich | HT5011 |
References
- Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
- Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
- Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
- Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).
