Summary
שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.
Abstract
יתושים הם וקטורים עבור מספר גורמי מחלות ומזיקים כגון וירוס קדחת צהובה, טפילי מלריה ותולעים filarial. מעבדות חוקרת אנטי הפתוגן מרכיבים של מערכת החיסון המולדת של וקטור מחלת מין בתקווה ליצור יתושים מהונדס, כי הם מגיבים פתוגנים כגון 1, 2. מערכת החיסון המולדת של יתושים כולל כמה שורות של הגנה 3. פתוגנים שמצליחים לברוח המכשול שהוטלו על ידי יתוש אפיתל מצופה midgut 4 להיכנס hemolymph והמפגש hemocytes במחזור, מרכיבים תאיים חשובים לתמצת פתוגנים לבלוע 5, 6. החוקרים לא מצאו ראיות רקמות hematopoietic ב יתושים ראיות הנוכחי עולה כי מספר hemocytes קבוע על הופעתה מבוגרים המספרים בפועל עשוי לרדת כפי הגילאים יתושים 7. היכולת לזהות כראוי לאסוף hemocytes מפני חרקים חשוב מבחינה רפואית היא צעד חיוני ללימודי חסינות הסלולר. עם זאת, גודלו הקטן של יתושים נפח מוגבל של hemolymph מהווים אתגר לאיסוף תאים חיסוניים.
שתי שיטות לאיסוף הוקמה hemocytes יתושים כולל גירוש hemolymph מתוך חוטם לחתוך 8, ועקירה נפח (זלוף), שבו מלוחים מוזרק באזור necklike קרומי בין הראש לבין החזה (כלומר, צוואר הרחם) לבין hemolymph perfused נאסף מפתיחת קרוע באזור הדיסטלי של הבטן 9, 10. טכניקות אלו, לעומת זאת, מוגבלים על ידי התאוששות נמוכה של hemocytes וזיהום אפשרי על ידי תאים שומן בגוף, בהתאמה 11. לאחרונה שיטה המכונה התאוששות הזרקה / התאוששות גבוהה משופרת של immunocytes על ידי שימוש מאגרים קרישה תוך הפחתת רמות זיהום קשקשים ורקמות פנימיות 11. אמנם שיטה המאפשרת שיטה משופרת של איסוף ושמירה hemocytes לתרבות העיקרי, הוא טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף שאינם נחוצים אם המטרה היא לאסוף את הזרם, לתקן כתם hemocytes עבור אבחון. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו של איסוף hemolymph יתוש המשלבת את הפשטות של זלוף, באמצעות מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח, עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים.
Discussion
שיטת איסוף hemocyte המתואר כאן הוא שונה משיטות שפורסמו בעבר ומאפשר לבודד את ההכנות נקי של hemocytes מ Aedes יתושים בצעדים פחות. בעוד עניין מיוחד שלנו טמון באפיון האוכלוסיות hemocyte ב Aedes יתושים, אנו מאמינים כי הטכניקה הזו יכול להיות מיושם על קבוצות אחרות יתוש לאחר הניסויים הראשוניים נערכים כדי לקבוע כרכים זריקה נכונה. פרוטוקול שלנו משתמשת מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח והתשואות אוכלוסייה של hemocytes זה משקף במדויק את המספרים in vivo. עם זאת, אנו לא נקבעה התאמה של פרוטוקול שלנו לשמירה על hemocytes מבודד בתרבות.
אוסף של hemolymph דרך חוטם חתך הוכח על מנת להביא למספר הנמוך ביותר של hemocytes במחזור ולא יידונו עוד כאן. זלוף שיטות מבוססות, בעוד קל לנהל, יש ביקורת על ומאפשר רמה גבוהה יותר של זיהום רקמות פנימיות קשקשים 11. לאחרונה, גבוה הזרקה / התאוששות שיטות פותחו כדי לשפר את ההתאוששות של hemocytes, תוך הפחתת רמות של 11 מזהם, אך טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף. פרוטוקול שלנו להשיג את אותה רמת hemocytes התאושש מזהמים מופחת אבל עם זריקה פחות צעדים איסוף, ובכך מציע שיטה פשוטה אך מדויקת כדי להשיג ההכנות נקי של hemocytes. ראשית, צעד פשוט בפרוטוקול שלנו רגליים, כנפיים הסרת וקצה הבטן במיכל נפרד מהמקום שבו נאסף hemolymph תוצאות בהכנות שואב הרבה hemocytes. שנית, רווחי השיטה שלנו דיוק על ידי שימוש במחטים זכוכית שנערך בעל מחט מחוברת חיובית, עקירה microinjector. בעוד diluent יכול גם להיות מוזרק באמצעות כף יד מחטים או אחר המוחזק ביד התקנים משלוח, שימוש microinjector מגדילה את הדיוק של נפח המסירה ובעקבות התוצאות בנפח עקבית של hemolymph שנאספו. הניסויים שלנו מצביעים על כך כרכים זריקה משולבת של μl 9.5-10.5 (צעדים 4.1 ו 4.4) אפשרה לנו לאסוף בעקביות 9-10 μl של hemolymph מפני יתושים נקבה מוזרק (נתונים שלא פורסמו), ובכך לספק אחר מדד של עקביות לכימות אוכלוסיות hemocyte. השיטה שלנו מפשט אוסף הכולל ידי הסרת הצורך אחר המוחזק ביד מחטי הזרקה ו / או צינורות זכוכית נימי לאסוף hemolymph בדילול מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ג'ון פריי ובן פיטרסון לגידול יתושים. אנו מודים גם כריסטין דייוויס גארי רדיס לעזרה עם micrographs hemocyte. מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת ריצ'מונד אומנויות & המילגה המדע הקיץ AA Qayum ואנשי סגל להעניק א טלנג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
