Summary
Un semplice ma accurato metodo per raccogliere e macchia ematociti concentrati zanzara è descritto. Il nostro metodo combina la semplicità di perfusione con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare. Questo metodo facilita la conoscenza di studi che richiedono i tipi di ematociti concentrati e la loro abbondanza.
Abstract
Le zanzare sono vettori di una serie di agenti patogeni che causano malattie come il virus della febbre gialla, malaria, parassiti e vermi filarial. Laboratori stanno studiando anti-patogeno componenti del sistema immunitario innato nella specie dei vettori di malattie, nella speranza di generare zanzare transgeniche che sono refrattari agli agenti patogeni quali 1, 2. Il sistema immunitario innato di zanzare è composto da diverse linee di difesa 3. Agenti patogeni che riescono a sfuggire alla barriera imposta dalla epitelio-allineata zanzara midgut 4 Inserire il emolinfa e di incontro ematociti concentrati in circolazione, importanti componenti cellulari che incapsulano e patogeni fagocitare 5, 6. I ricercatori non hanno trovato prove per i tessuti emopoietici in zanzare e fatti suggeriscono che il numero di ematociti concentrati è fissato a emergere per adulti e numeri può effettivamente diminuire con l'invecchiamento della zanzara 7. La capacità di raccogliere correttamente e identificare ematociti concentrati dagli insetti medicalmente importante è un passo essenziale per gli studi di immunità cellulare. Tuttavia, la dimensione piccola delle zanzare e il volume limitato di emolinfa rappresentano una sfida a raccogliere le cellule immunitarie.
Due metodi per la raccolta di ematociti concentrati zanzara comprendono espulsione di emolinfa da un taglio proboscide 8, e lo spostamento del volume (perfusione), in cui viene iniettato soluzione salina nella regione membranosa necklike tra la testa e torace (cioè, cervice) e la perfusione emolinfa viene raccolta da un'apertura strappato in una regione distale dell'addome 9, 10. Queste tecniche, tuttavia, sono limitate da basso recupero di ematociti concentrati e di possibile contaminazione da parte delle cellule di grasso corporeo, rispettivamente 11. Più recentemente un metodo denominato di iniezione ad alta / recupero di un migliore recupero immunocytes mediante l'uso di tamponi anticoagulanti, riducendo i livelli di contaminanti scale e tessuti interni 11. Anche se questo metodo permette un metodo migliorato di raccolta e di conservazione ematociti concentrati per la cultura primaria, che comporta un certo numero di iniezione e fasi di raccolta che non sono necessari se l'obiettivo a valle è quello di raccogliere, fissare e macchia ematociti concentrati per la diagnostica. Qui, dimostriamo il nostro metodo di raccolta emolinfa zanzara che unisce la semplicità di perfusione, utilizzando tamponi anticoagulante al posto della soluzione fisiologica, con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare.
Protocol
1. Preparazione in anticipo della raccolta hemocyte
- Preparare una soluzione diluente emolinfa che consiste di 60% di media Schneider, 10% di siero fetale bovino (FBS) e tampone citrato 30% (anticoagulante; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 ml Acido citrico, pH 4,5) 11. Fai aliquote 1,0 ml che possono essere conservati a -20 ° C. Utilizzare ciascuna aliquota solo una volta (vedi Materiali).
- Preparare vetrini da microscopio in vetro (75 x 25 x 1 mm) segnando un 1 cm di diametro cerchio ad una estremità con un vetro incisione strumento. In alternativa, vetrini da microscopio con due pre-inciso circoli possono essere acquistati (ad esempio Fisher Scientific o fonti EMS). Una lastra di vetro per le zanzare saranno necessari.
- Preparare un set di aghi di vetro (vedi Materiali) tirato in base alle seguenti impostazioni suggerite (Sutter Instruments, modello P-87):
Rampa di calore 5 Pull: 45 Vel: 75 Tempo: 175 Pressione 580
Utilizzando le impostazioni consigliate su questo estrattore, costruiamo aghi che sono circa 500 mm di lunghezza complessiva con gambo lunghezza di circa 3 mm. Pre-tirato aghi possono anche essere acquistati (ad esempio Tritech Ricerca).
2. Preparazione del microinjector in anticipo della raccolta hemocyte
- Inserire un ago tirato in porta aghi microinjector secondo le istruzioni del produttore. Backfill il (vedi Materiali) microinjector tubi, siringhe e tirò ago di vetro con olio minerale secondo le istruzioni del produttore.
3. Preparazione di zanzare femmine in anticipo della raccolta hemocyte
- Aspirare 15 femmine adulte in piccoli contenitori gabbia solido che può essere in contatto con il ghiaccio. Gabbia immergere con le zanzare nel ghiaccio abbastanza profondo in modo che l'intera altezza della gabbia e da tutte le parti sono in contatto con il ghiaccio. Questo farà sì che tutte le zanzare saranno esposti al freddo.
Freddo zanzare anestetizzare per circa 8 minuti o fino a quando non sono più mobili. - Mettere una zanzara in una diapositiva depressione. Questa diapositiva servirà come sito per preparazioni iniettabili.
4. Raccolta Hemocyte
- Impostare il microinjector a raccogliere 12 ml di diluente emolinfa in ago di vetro tirato e iniettare la soluzione nella zanzara tra i segmenti settima e l'ottava addominale. Circa 3 zanzare possono essere iniettati con 3-3,5 l di totale 12 microlitri di volume occupato. La zanzara deve essere delicatamente tenuta in posizione con una pinza, mentre l'iniezione viene eseguita. Una piccola quantità di diluente deve rimanere alla punta dell'ago in modo da evitare l'olio minerale venga iniettato. Dopo l'iniezione l'addome dovrebbe essere "riempita" o gonfio.
- Luogo iniettato zanzare in un contenitore separato pulito sul ghiaccio per recuperare per 5 min. L'incubazione della soluzione diluente anticoagulante all'interno della zanzara aiuterà sloggiare ematociti concentrati aderendo ai tessuti interni. In media 3-5 zanzare fresca può essere iniettato durante ogni periodo di 5 minuti di recupero.
- Dopo 5 minuti di recupero, snip fuori le gambe, le ali e la punta dell'addome (al segmento ottavo) di ciascuno zanzara in un momento con le forbici micro. Questo dovrebbe essere fatto nella coppa di recupero posti su ghiaccio. Tagliare le gambe e le ali riduce la probabilità di scale di essere trasferito a raccolta diapositive. Nota: non tagliare le gambe e le ali troppo vicino ai siti attaccamento toracica o si rischia di creare altre aperture per emolinfa di scappare. Emolinfa devono essere raccolti attraverso l'apertura creata sulla punta del ventre.
- Lavarsi vetrino da microscopio in vetro inciso con il 70% etanolo e asciugare con un kimwipe. Una posizione iniettato e recuperato zanzara sulla diapositiva sul bordo esterno del cerchio inciso. Impostare microinjector per raccogliere 12 ml di diluente emolinfa fresca e iniettare in questo volume la zanzara nella parte laterale della sua mesotorace. Fornire la maggior parte ma non l'intero volume di diluente (circa 8 - 10 mL) in modo da evitare l'olio minerale venga iniettato. Una piccola quantità di diluente deve rimanere alla punta dell'ago.
- Posizionare la zanzara in modo che l'apertura taglio addominale è al bordo del cerchio di 1 cm. Dopo l'iniezione l'emolinfa diluita deve essere raccolti all'interno dell'area contrassegnata. Una volta che l'ago viene rimosso dal sito di iniezione mesothoracic, riprendere tenendo la zanzara tra i due bracci della pinza e spremere delicatamente l'addome con le pinze per dirigere l'emolinfa sulla zona cerchio inciso.
- Lasciare emolinfa diluita ad asciugare su slitta per circa 10 minuti o fino a quando è visibilmente asciutto.
5. Hemocyte fissazione e colorazione
- Macchia ogni diapositiva separatamente con HEMA3 7 (vedi Materiali): Dip slide in fissativo 5 volte per 1 secondo ogni volta; Dipslide in soluzione I 3 volte per 1 secondo ciascuna, e, infine, dip scivolare in soluzione II, 3 volte per 1 secondo ciascuna. Lavare la parte posteriore del vetrino con acqua deionizzata. La parte anteriore della slitta non deve essere risciacquato. Blot-asciugare la parte anteriore della slitta fuori cerchio inciso contenenti tessuto colorato.
- Applicare mezzo di montaggio (ad esempio Sur / o Monte Polymount) intorno al centro inciso e mettere un coperchio scivolare su di esso. Premere leggermente sul vetrino (25 x 25 mm) in modo che gli spread medio di montaggio per l'intera area coperta dal vetrino (compresi cerchio inciso contenenti tessuto colorate). Lasciare i vetrini si asciughino per un minimo di 3 ore o durante la notte. Ematociti concentrati deve essere considerato entro 2 settimane dopo la raccolta per la visualizzazione ottimale e di imaging.
6. Rappresentante Risultati
Esempi di ematociti concentrati colorati fissi e HEMA3 raccolti da una femmina di Aedes aegypti adulti sono mostrati nella Figura 1A-C. La figura 1A mostra un hemocyte che abbiamo identificato come un prohemocyte in base alla sua piccola dimensione, forma sferica-sferoidale e di alta nucleare rapporto citoplasma (ingrandimento 550X) 11. Figura 1B mostra un hemocyte classificata come oenocytoid in base alla sua forma sferoidale e citoplasma elevato rapporto nucleare (ingrandimento 550X). Infine, la Figura 1C mostra un tipo di granulociti-hemocyte (ingrandimento 550X). Granulociti sono più granulari in natura e tendono ad essere più ameboide in forma e il comportamento che aderiscano alle superfici di vetro. Impiegando criteri pubblicati per la tipizzazione hemocyte e recupero 11, il nostro metodo di raccolta ha prodotto un numero simile di ematociti concentrati totali e abbiamo anche scoperto che i granulociti costituiscono la più alta percentuale di ematociti concentrati totale 11 (Fig. 2).
Figura 1. Immagini al microscopio luce di un rappresentante HEMA3 fisso, prohemocyte macchiato (A), oenocytoid (B), e dei granulociti (C) da un Ae. aegypti femmina adulta. C = citoplasma, nucleo N = G = granuli.
Figura 2. Conta totale ± SE di tutti ematociti concentrati e granulociti ottenuta per zanzara femmina dal nostro diluizione emolinfa e metodo di raccolta.
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Discussion
Il metodo di raccolta hemocyte qui descritto è stato modificato dai metodi precedentemente pubblicato e permette di isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati da zanzare Aedes con meno passaggi. Mentre il nostro particolare interesse risiede nel caratterizzare popolazioni hemocyte in zanzare Aedes, crediamo che questa tecnica può essere applicata a gruppi di altre zanzare, dopo gli studi iniziali condotti per determinare il volume d'iniezione appropriate. Il nostro protocollo utilizza buffer anticoagulante al posto della soluzione fisiologica e produce una popolazione di ematociti concentrati che riflette con precisione i numeri in vivo. Tuttavia, non abbiamo ancora determinato l'idoneità del nostro protocollo per il mantenimento ematociti concentrati isolato in coltura.
Raccolta di emolinfa attraverso una proboscide taglio ha dimostrato di produrre il minor numero di ematociti concentrati in circolazione e non saranno ulteriormente discussi qui. Perfusione metodi basati, mentre facile da condurre, sono stati criticati per aver permesso un maggior livello di contaminazione da tessuti interni e scale 11. Recentemente, iniezione ad alta / recupero sono stati sviluppati metodi per migliorare il recupero di ematociti concentrati, riducendo al contempo i livelli di contamina 11, ma comporta una serie di iniezione e fasi di raccolta. Il nostro protocollo ottenuto lo stesso livello di ematociti concentrati recuperato e contaminanti ridotto ma con un minor numero di iniezione e fasi di raccolta, offrendo un metodo semplice ma preciso di ottenere preparazioni pulita di ematociti concentrati. In primo luogo, il semplice passo nel nostro protocollo di rimozione di gambe, ali e la punta dell'addome in un contenitore separato da dove emolinfa viene raccolto risultati in preparazioni molto più pulito di ematociti concentrati. In secondo luogo, il nostro metodo accuratezza guadagni utilizzando aghi di vetro, mantenute in un supporto ad un ago inserito spostamento positivo microinjector. Mentre diluente può anche essere iniettato con mano aghi o altri dispositivi palmari di consegna, l'uso di un microinjector aumenta la precisione del volume di consegna e di conseguenza si traduce in costante del volume di emolinfa raccolti. Le nostre prove indicano che i volumi di iniezione combinato di 9,5-10,5 microlitri (passi 4.1 e 4.4) ci ha permesso di raccogliere costantemente 9-10 ml di emolinfa dal iniettato zanzare femmine (dati non pubblicati), fornendo così un'altra misura di coerenza nel quantificare le popolazioni hemocyte. Il nostro metodo semplifica la raccolta complessiva, eliminando la necessità di altri portatili aghi da iniezione e / o tubi di vetro capillare per raccogliere emolinfa diluita.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Autori desiderano ringraziare Frey John e Ben Peterson per l'allevamento di zanzare. Ringraziamo anche Christine Davis e Gary Radice per un aiuto con micrografie hemocyte. Questa ricerca è stata finanziata dalla University of Richmond Arte e Scienza di borsa di studio estiva AA Qayum e docenti concedere ad A. Telang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
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