Summary
記述されている蚊の血球細胞を収集して染色する、まだ正確な方法を簡素化。私たちの方法は、ヒトスジシマカ蚊の血球のクリーンな準備を分離するために、高いインジェクション技術の精度で灌流のシンプルさを兼ね備えています。このメソッドは、血球とその豊かさの種類の知識を必要とする研究を促進する。
Abstract
蚊は、黄熱病ウイルス、マラリア原虫やフィラリアワームなどの病気を引き起こす病原体の数のベクトルです。研究所は、そのような病原体1,2に抵抗性遺伝子組換え蚊を発生させることを望んで病気のベクトルの種の自然免疫系の抗病原体成分を調査している。蚊の自然免疫系は防御3の複数の行で構成されています。上皮で裏打ちされた蚊中腸4で課された障壁を逃れるために管理する病原体は血リンパを入力し、循環血球、カプセル化する重要な細胞成分と巻き込むの病原体5,6が発生する 。研究者は、蚊に造血組織のための証拠を発見していないと、現在の証拠は、血球の数が羽化に固定され、数字が実際に蚊の7歳と低下する場合があることを示唆している。適切に収集し、医学的に重要な昆虫から血球を識別する能力は、細胞性免疫の研究に不可欠なステップです。しかし、蚊と血リンパの限られた容積の小さいサイズは、免疫細胞を収集するために挑戦をもたらす。
蚊血球を収集するための2つの確立された方法は、頭部と胸部の間に膜necklike領域（すなわち、子宮頸部）に注入され、灌流血リンパが収集される生理食塩水でカット口先8、およびボリュームの変位（灌流）、からの血リンパの除名を含む腹部9、10の遠位領域内の引き裂かれた開口部から。これらの技術は、しかし、それぞれ11、血球の低い回収と脂肪体細胞による汚染の可能性によって制限されている。スケールと内部の組織11を汚染のレベルを低減しつつ、より多くの最近の方法は、抗凝固剤のバッファを使用することによって免疫細胞の高い注入/回収の改善回復と呼びます。その方式で初代培養のための血球を収集し、維持する改良法を可能にする一方で、それは注射の数を伴いますし、下流の目標は、収集、修正および診断のための血球を染色する場合に必要ではないステップを収集。ここでは、 ネッタイシマカ蚊の血球のクリーンな準備を分離するために、高いインジェクション技術の精度で、生理食塩水の代わりに抗凝固剤のバッファを使用して、血流のシンプルさを組み合わせた蚊の血リンパの収集の私達の方法を示しています。
Protocol
1。血球コレクションの事前準備
- （は98 mMのNaOHを、186 mMのNaCl、1.7 mMのEDTA、41 mMクエン酸、pH4.5の抗凝固剤）60％シュナイダーの培地、10％ウシ胎児血清（FBS）、および30％クエン酸緩衝液で構成される体液の希釈溶液を調製11。 -20℃で保存することができます1.0mLのアリコートを作る（資料を参照してください）一度だけ各アリコートを使用してください。
- ガラスエッチングのツールを使用して、一端に直径1cmの円形の得点によって顕微鏡用スライドガラス（75 × 25 × 1 mm）を準備する。また、2つの事前エッチング円と顕微鏡のスライドは、（例えば、フィッシャーサイエンティフィックまたはEMSの源）で購入することができます。蚊ごとにスライドガラスが必要となります。
- ガラス針のセットを準備する（資料を参照）、以下の推奨設定（サッタインスツルメンツ、モデルP - 87）によるとプル。
ヒートランプ5 プル：45 ヴェル：75 時間：175 圧力580
このプーラーで提案された設定を使用して、我々は、約3mmのシャンクの長さと全体の長さは500 mm程度である針を構築する。事前に引っ張ら針はまた（例えばTritech研究）購入することができます。
2。血球コレクションの事前に微量注入器の準備
- 製造元の指示に従って、インジェクターのニードルホルダーに引っ張ら針を挿入します。埋め戻しは、インジェクター（資料を参照）チューブ、注射器とは、製造元の指示に従って、鉱物油とガラスの針を引っ張った。
3。血球コレクションの事前にメスの蚊の準備
- 氷と接触することができる小さな固体ケージの容器に15、成人女性を吸引除去する。深く十分なケージとすべての側面のその高さ全体が氷と接触しているので、氷の蚊と浸しケージ。これは、すべての蚊が低温にさらされるようになります。
約8分まで、または冷たい麻酔の蚊は、彼らはもはやモバイルではありません。 - うつ病のスライドにone蚊を置きます。このスライドは、注射のためのサイトとして機能します。
4。血球コレクション
- プルガラス針に血リンパの希釈液の12μlを取り上げ、7位と8腹部セグメント間の蚊に溶液を注入するインジェクターを設定します。約3蚊が取り上げ合計12μlの体積の3から3.5μLを注入することができます。注入が行われる間、蚊を穏やかに鉗子で定位置に保持されるべきである。希釈剤の少量が注入されるから、鉱物油を防ぐために、針の先端に残るはず。注入後腹部には"充填"や肥大化になるはずです。
- 5分で回復するために氷上で別々の清潔な容器に注入された蚊を置きます。蚊内部の抗凝固剤希釈液のインキュベーションでは、内部組織に付着した血球を取り除くのに役立ちます。平均で3〜5新鮮な蚊は、各5分間の回復期間中に注入することができる。
- 回復の5分後、足、翼、そしてマイクロはさみを使って一度に各蚊つの腹部の先端（第8セグメントで）オフスニップ。これは、氷上に置く回復カップで行う必要があります。脚と翼を切断すると、コレクションのスライドに転送されるスケールの可能性を減らすことができます。注：あまりにも胸の付着部位に近い足と羽をカットしたり、エスケープする血リンパための他の開口部を作成する危険はありません。血リンパは、腹部の先端に作成された開口部を通して収集する必要があります。
- 70％エタノールでのガラスエッチング顕微鏡スライドを洗浄し、キムワイプでそれを乾燥させます。位置1は、エッチングされた円の外側の端にスライド上に蚊を注入して回復した。新鮮な血リンパの希釈液の12μlをピックアップし、その中胸の横側に蚊にこのボリュームを注入するインジェクターを設定します。注入されるから、鉱物油を防ぐために - 希釈剤の全体量（10μlの約8）ではない、ほとんどの実現が。希釈剤の少量は、針の先端に残るはず。
- カット腹部の開口部が1cmの円形の端になるように蚊を配置します。注入後希釈血リンパはマークされた領域内で収集する必要があります。針がmesothoracic注射部位から削除されると、鉗子の2つのアームの間に蚊を保持し、静かにエッチングされた丸い部分の上に血リンパを指示するために、これらの鉗子で腹部を圧迫を再開する。
- 希薄化後の血リンパは約10分間、またはそれが目に見えて乾燥するまでスライド上で乾燥することができます。
5。血球固定と染色
- ディップS：HEMA3 7（資料を参照）で別々に各スライドを染色たびに1秒のための固定液に5回の李徳、それぞれ1秒間と、最後に、ソリューションIIのディップスライドが3回、私は各1秒に対して3倍の溶液中でDipslide。 DI水でスライドの後ろをすすぐ。スライドの前面を洗浄してはいけません。ステンド組織を含むエッチングされた円の外側のスライドの前面にしみ、乾燥させます。
- エッチングされた中心の周りに取り付け媒体（例えば、シュール/マウントまたはPolymount）を適用し、その上にカバースリップを配置。ようにカバースリップ（25 × 25 mm）の上を軽く押し下げてそのカバースリップ（ステンド組織を含むエッチング円を含む）でカバーエリア全体への封入剤が広がる。スライドは3時間または一晩の最低を乾かせてください。血球は、最適な可視化と画像の収集後2週間以内に表示する必要があります。
6。代表的な結果
ネッタイシマカ大人の女性から採取した固定とHEMA3ステンド血球の例を図1A - Cに示されています。図1Aは、我々は細胞質比（550x倍率）〜11核のサイズが小さく、球形、回転楕円体の形状及び高に基づいてprohemocyteとして識別血球を示しています。図1Bは、回転楕円体の形状と核の比（550x倍率）の高い細胞質に基づいてoenocytoidとして分類血球を示しています。最後に、図1Cは、顆粒球型血球（550x倍率）を示しています。顆粒球は自然の中で、よりきめ細かなものであり、彼らはガラスの表面に付着するような形状と動作に、よりアメーバの傾向にある。血球タイピングおよび回復11の以前に発行された基準を使用して、私たちの収集方法は、総血球の同じような数を生み出し、我々は同様に顆粒球は総血球11（図2）の最大の割合を構成していることがわかった。
図1代表的なHEMA3固定、染色したprohemocyteの光学顕微鏡像（）、oenocytoid（B）、およびAEから顆粒球（C）。ネッタイシマカの大人の女性。 C =細胞質、N =核、G =顆粒。
図2。合計カウント±私たちの体液の希釈と収集法でメス蚊ごとに得られるすべての血球と顆粒球のSE。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
血球収集方法は、以前に発行されたメソッドから変更と1つのより少ない手順でヒトスジシマカ蚊から血球のクリーンな準備を分離することができますされ、ここで説明。私たちの特定の関心は、 ヒトスジシマカ蚊の血球集団を特徴付けるにある一方で、我々は最初の試験が適切な注入量を決定するために実施された後、この手法は他の蚊のグループに適用できると考えています。我々のプロトコルは、生理食塩水の代わりに抗凝固剤のバッファを使用し、正確に生体内での番号を反映する血球の人口が得られます。しかし、我々はまだ文化の中で孤立した血球を維持するためのプロトコルの適合性を決定していない。
カットの口吻を経由して血リンパのコレクションは、循環血球数が最も少ないが得られることが示されているとさらにここでは説明しません。血流ベースの方法、簡単に行うために一方は、内部組織とスケール11からの汚染の高いレベルを可能にするために批判されている。最近、高注入/回収の方法は、汚染物質11のレベルを削減しながら、血球の回復を向上させるために開発が、注射と収集ステップ数を伴いますいた。我々のプロトコルは、それによって血球のきれいな準備を取得するためにシンプルで正確な方法を提供し、回収した血球系の減少汚染物質の数は少なく注入と収集のステップと同じレベルを得ること。私たちの足を除去するのプロトコル、翼と血リンパは血球のよりクリーンな準備の結果を収集されている場所から別の容器に腹部の先端の最初の、シンプルなステップ。第二に、容積式マイクロインジェクターに接続されているニードルホルダーで開催されたガラスの針を利用することにより、提案手法のゲイン精度。希釈剤は、同様に、ハンドヘルド針やその他のハンドヘルド配信デバイスを使用して注入することができるが、微量注入器の使用は、配信量と収集した血リンパの一定の音量に続いて結果の精度を向上させます。私たちの試験では、9.5から10.5μL（ステップ4.1および4.4）のその組み合わせの注入量を示すことにより、血球集団の定量化に一貫性の別の尺度を提供し、私たちは一貫して注入したメスの蚊（未発表データ）から体液の90〜10μlを収集することができました。私たちの方法は、希薄化後の血リンパを収集するその他の携帯型注射針及び/またはガラスキャピラリーチューブの必要性を除去することによってコレクション全体を簡素化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、蚊飼育用ジョンフレイとベンピーターソンに感謝します。我々はまた、血球の顕微鏡写真のヘルプはクリスティンデイビスとゲイリーRadiceに感謝。この研究は、A.テーラングにAA Qayumと教員の助成金にリッチモンドアーツ＆サイエンスサマーフェローシップ大学によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
