Summary
Een vereenvoudigde toch nauwkeurige methode voor het verzamelen en vlekken mug hemocytes wordt beschreven. Onze methode combineert de eenvoud van perfusie met de nauwkeurigheid van hoge injectie technieken om schoon voorbereidingen van hemocytes in Aedes muggen te isoleren. Deze methode maakt studies vereist kennis van de soorten hemocytes en hun overvloed.
Abstract
Muggen zijn vectoren voor een aantal ziekteverwekkende pathogenen, zoals de gele koorts virus, malaria parasieten en filaria wormen. Laboratoria onderzoeken anti-pathogeen componenten van het aangeboren immuunsysteem bij de ziekte van vectorsoorten in de hoop van het genereren van transgene muggen die ongevoelig zijn voor een dergelijke pathogenen 1, 2. Het aangeboren immuunsysteem van muggen bestaat uit verschillende lijnen van de verdediging 3. Pathogenen die erin slagen om de barrière opgelegd door de epitheel-omzoomde muggen middendarm 4 te ontsnappen gaan de hemolymfe en ontmoeting circulerende hemocytes, belangrijke cellulaire componenten die in te kapselen en verzwelgen pathogenen 5, 6. Onderzoekers hebben geen bewijs gevonden voor hematopoietische weefsels in de muggen en de huidige gegevens wijzen erop dat het aantal hemocytes is vastgesteld op volwassen opkomst en het aantal kan zelfs afnemen als de mug leeftijd 7. Het vermogen om goed te verzamelen en te identificeren hemocytes van medisch belangrijke insecten is een essentiële stap voor studies in de cellulaire immuniteit. Echter, de geringe omvang van muggen en de beperkte volume van hemolymfe vormen een uitdaging voor het verzamelen van immuuncellen.
Twee gevestigde methoden voor het verzamelen muggen hemocytes zijn uitzetting van hemolymfe van een snee slurf 8, en het volume verplaatsing (perfusie), waarin de zoutoplossing wordt in de vliezige necklike gebied geïnjecteerd tussen de kop en de thorax (dat wil zeggen, cervix) en de geperfuseerde hemolymfe wordt verzameld uit een gescheurde opening in een distale regio van de buik 9, 10. Deze technieken zijn echter beperkt door de lage herstel van de hemocytes en mogelijke vervuiling door vet lichaamscellen, respectievelijk 11. Meer recent een methode aangeduid als high injectie / herstel verbeterde terugvordering van de immunocytes door het gebruik van anticoagulantia buffers terwijl het verminderen van het niveau van verontreinigende schalen en de interne weefsels 11. Terwijl die methode zorgt voor een verbeterde methode voor het verzamelen en onderhouden van hemocytes voor de primaire cultuur, het betekent een aantal van de injectie en het verzamelen van stappen die niet nodig zijn als de stroomafwaartse doel is het verzamelen, repareren en vlek hemocytes voor de diagnostiek. Hier tonen we onze methode voor het verzamelen van muggen hemolymfe dat de eenvoud van perfusie gecombineerd, met behulp van anti-stollingsmiddel buffers in plaats van een zoutoplossing, met de nauwkeurigheid van de hoge injectie technieken om schoon voorbereidingen van hemocytes in Aedes muggen te isoleren.
Protocol
1. Voorbereiding van hemocyte collectie
- Bereid een hemolymfe verdunningsmiddel oplossing die bestaat uit 60% Medium van Schneider, 10% foetaal bovine serum (FBS), en 30% citraatbuffer (antistollingsmiddel, 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM citroenzuur, pH 4,5) 11. Maak 1,0 mL porties die kan worden opgeslagen bij -20 ° C. Gebruik elk aliquot slechts een keer (zie ook Materiaal).
- Bereid glazen objectglaasjes (75 x 25 x 1 mm) met het noteren van een 1 cm cirkel met een diameter aan de ene kant met behulp van een glas-etsen tool. Als alternatief kan microscoopglaasjes met twee pre-geëtst kringen worden gekocht (bv. Fisher Scientific of EMS bronnen). Een glaasje per mug nodig zal zijn.
- Bereid een reeks glazen naalden (zie ook Materiaal) getrokken op basis van de volgende voorgestelde instellingen (Sutter Instruments, Model P-87):
Warmte Ramp +5 Pull: 45 Vel: 75 Tijd: 175 Druk 580
Met behulp van de voorgestelde instellingen op dit trekker, we bouwen naalden die ongeveer 500 mm zijn in de totale lengte met steel een lengte van ongeveer 3 mm. Pre-getrokken naalden kunnen ook worden aangekocht (bijv. TriTech Onderzoek).
2. De voorbereiding van microinjector van tevoren hemocyte collectie
- Plaats een getrokken naald in de microinjector naaldhouder volgens de instructies van de fabrikant. Backfill de microinjector (zie ook Materiaal) slang, spuit en trok glazen naald met minerale olie volgens de instructies van de fabrikant.
3. Voorbereiding van de vrouwelijke muggen bij voorbaat van hemocyte collectie
- Aspireren 15 volwassen vrouwtjes in kleine stevige kooi containers die kunnen worden in contact komen met ijs. Dompel kooi met muggen in ijs diep genoeg zodat de volledige hoogte van de kooi en alle kanten in aanraking komen met ijs. Dit zal ervoor zorgen dat alle muggen zullen worden blootgesteld aan de kou.
Koud verdoven muggen voor ongeveer 8 minuten of tot ze niet meer mobiel. - Plaats een mug op een depressie dia. Deze dia zal dienen als de locatie voor injecties.
4. Hemocyte collectie
- Stel de microinjector tot het nemen van 12 pi van hemolymfe verdunningsmiddel in getrokken glas naald en de oplossing te injecteren in de mug tussen de zevende en achtste abdominale segmenten. Ongeveer 3 muggen kunnen worden geïnjecteerd met 3 tot 3,5 ul van het totale volume van 12 ul genomen. De mug moet voorzichtig zijn plaats worden gehouden met een pincet terwijl de injectie wordt uitgevoerd. Een kleine hoeveelheid oplosmiddel moet blijven aan het uiteinde van de naald, om minerale olie voorkomen dat geïnjecteerd. Na de injectie de buik eruit moet zien "gevuld" of opgeblazen.
- Plaats geïnjecteerd muggen in een aparte schone container op ijs om te herstellen gedurende 5 minuten. De incubatie van de anti-stollingsmiddel verdunningsmiddel oplossing in de mug zal helpen los hemocytes de naleving van interne weefsel. Op gemiddeld 3 tot 5 verse muggen kan worden geïnjecteerd tijdens elke 5 minuten herstelperiode.
- Na 5 minuten van het herstel, knip poten, vleugels en de punt van de buik (op de achtste segment) van elke mug een voor een met behulp van micro-schaar. Dit dient te gebeuren in het herstel beker geplaatst op ijs. Het afsnijden van de poten en vleugels verkleint de kans van schalen wordt overgebracht naar collectie dia's. Let op: niet snijden poten en vleugels te dicht bij thoracale attachment sites of loopt u het risico het maken van andere openingen voor hemolymfe te ontsnappen. Hemolymfe mag alleen worden geïnd door de opening gecreëerd op het puntje van de buik.
- Was een glas geëtst microscoopglaasje met 70% ethanol en droog het met een kimwipe. Plaats een geïnjecteerd en hersteld mug op de dia op de buitenste rand van de geëtste cirkel. Stel microinjector op te pikken 12 ul van verse hemolymfe verdunningsmiddel en dit volume te injecteren in de mug in de laterale kant van zijn mesothorax. Leveren de meeste, maar niet het gehele volume van de oplosmiddel (ongeveer 8 - 10 pi) om minerale olie voorkomen dat geïnjecteerd. Een kleine hoeveelheid oplosmiddel moet blijven aan het uiteinde van de naald.
- Plaats de mug, zodat de cut buik opening aan de rand van de cirkel 1 cm. Na de injectie de verdunde hemolymfe moeten worden verzameld binnen het gemarkeerde gebied. Zodra de naald is verwijderd van de mesothoracic injectieplaats, hervatten houdt de mug tussen de twee takken van de tang en voorzichtig de buik knijpen met die tang van de hemolymfe direct op de geëtste cirkel gebied.
- Laat verdund hemolymfe om op dia drogen ongeveer 10 minuten of totdat het zichtbaar droog.
5. Hemocyte fixatie en kleuring
- Afzonderlijk vlek elke dia met HEMA3 7 (zie ook Materiaal): Dip sLiDE in fixatief vijf keer voor een seconde elke keer; Dipslide in de oplossing die ik drie keer voor een seconde elk; en, ten slotte, dip dia in oplossing II 3 keer voor een seconde elk. Spoel de achterkant van de dia met DI water. De voorkant van de dia moet niet gespoeld worden. Dep droog de voorkant van de dia buiten geëtste cirkel met daarin gekleurd weefsel.
- Van toepassing zijn montage medium (bijv. Sur / Mount of Polymount) rond de geëtste centrum en plaats een dekglas op. Druk lichtjes naar beneden op de cover slip (25 x 25 mm) zodat de montage medium uitbreidt tot het gehele gebied waarop het dekglas (inclusief geëtst cirkel met daarin gekleurde weefsel). Laat dia's drogen een minimum van 3 uur of 's nachts. Hemocytes moet worden gezien binnen 2 weken na de winning voor een optimale visualisatie en beeldvorming.
6. Representatieve resultaten
Voorbeelden van vaste en HEMA3 gebrandschilderde hemocytes verzameld van een Aedes aegypti volwassen vrouwtje zijn weergegeven in figuur 1A-C. Figuur 1a toont een hemocyte dat we geïdentificeerd als een prohemocyte op basis van zijn kleine formaat, bolvormige bolvormige-vorm en een hoge nucleair cytoplasma ratio (550x vergroting) 11. Figuur 1B toont een hemocyte geclassificeerd als een oenocytoid gebaseerd op de bolvormige vorm en een hoge cytoplasma naar nucleaire ratio (550x vergroting). Ten slotte Figuur 1C toont een granulocyt-type hemocyte (550x vergroting). Granulocyten zijn gedetailleerder van aard zijn en de neiging om meer amoeboid zijn in vorm en gedrag als zij zich aan glas oppervlakken. Met behulp van eerder gepubliceerde criteria voor hemocyte typen en het herstel 11, onze methode voor het verzamelen leverde een vergelijkbaar aantal van het totaal hemocytes en wij ook vonden dat granulocyten vormen de grootste percentage van de totale hemocytes 11 (afb. 2).
Figuur 1. Light microscoop beelden van een vertegenwoordiger HEMA3 vast, gekleurd prohemocyte (A), oenocytoid (B), en granulocyten (C) van een Ae. aegypti volwassen vrouwtje. C = cytoplasma, N = G = kern korrels.
Figuur 2. Totaal telt ± SE van alle hemocytes en granulocyten verkregen per vrouwelijke mug door onze hemolymfe verdunning en het verzamelen methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hemocyte collectie hier beschreven methode is aangepast van eerder gepubliceerde methoden en laat een schoon te maken bereidingen van hemocytes van Aedes muggen isoleren met minder stappen. Terwijl onze bijzondere interesse ligt in het karakteriseren van hemocyte populaties in Aedes muggen, geloven wij deze techniek kan worden toegepast op andere mug groepen na de eerste proeven worden uitgevoerd om de juiste injectie volumes te bepalen. Ons protocol maakt gebruik van anti-stollingsmiddel buffers in plaats van zoutoplossing en levert een populatie van hemocytes dat nauwkeurig weerspiegelt de nummers in vivo. We hebben echter nog niet bepaald de geschiktheid van ons protocol voor het behoud van geïsoleerde hemocytes in cultuur.
Het verzamelen van hemolymfe via een snede proboscis is aangetoond dat de minste aantal circulerende hemocytes opbrengst en zullen hier niet verder worden besproken. Perfusie-gebaseerde methoden, terwijl het eenvoudig uit te voeren, zijn kritiek voor het toestaan van een hoger niveau van verontreiniging van interne weefsels en schalen 11. Onlangs waren hoog injectie / recovery methoden ontwikkeld voor het herstel van de hemocytes te verbeteren, terwijl het verminderen van het niveau van 11 vervuilt, maar brengt een aantal van de injectie en het verzamelen van stappen. Ons protocol verkregen hetzelfde niveau van teruggewonnen hemocytes en minder vervuilende stoffen, maar met minder injectie en het verzamelen van de stappen, en biedt daarmee een eenvoudige en nauwkeurige methode om schoon voorbereidingen van hemocytes te verkrijgen. Ten eerste de eenvoudige stap in ons protocol van het verwijderen van poten, vleugels en de punt van de buik in een container los van waar hemolymfe wordt verzameld resulteert in een veel schonere voorbereidingen van hemocytes. Ten tweede, onze methode krijgt de nauwkeurigheid door het gebruik van glas naalden gehouden in een naaldhouder aan een verdringerpompen microinjector. Terwijl verdunningsmiddel kan eveneens worden geïnjecteerd met behulp van hand-held naalden of andere hand-held apparaten levering, het gebruik van een microinjector verhoogt de nauwkeurigheid van de geleverde hoeveelheid en vervolgens resulteert in consistente volume van de verzamelde hemolymfe. Onze studies tonen aan dat gecombineerde injectie volumes van 9,5 tot 10,5 ui (stappen 4.1 en 4.4) liet ons toe om constant te verzamelen 90-10 pi hemolymfe uit geïnjecteerd vrouwelijke muggen (niet gepubliceerde data), en bieden zodoende een andere maatregel van de consistentie in het kwantificeren van hemocyte populaties. Onze methode vereenvoudigt het totale collectie van het verwijderen van de noodzaak van andere hand-held injectienaalden en / of glazen capillaire buisjes tegen verdunde hemolymfe te verzamelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Auteurs willen graag John Frey en Ben Peterson bedanken voor muggen opfok. We danken ook Christine Davis en Gary Radice voor hulp bij hemocyte microfoto. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Universiteit van Richmond Arts & Science zomer fellowship naar AA Qayum en de faculteit te verlenen aan A. Telang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
