Summary
Eine vereinfachte, aber genaue Methode zu sammeln und zu färben Mücke Blutzellen beschrieben. Unsere Methode kombiniert die Einfachheit der Perfusion mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren. Diese Methode erleichtert Studien erfordern Kenntnisse über die Arten von Blutzellen und deren Hülle und Fülle.
Abstract
Moskitos sind Vektoren für eine Reihe von Krankheitserregern wie das Gelbfieber-Virus, Malaria Parasiten und Filarien. Laboratories untersuchen anti-Erreger Bestandteile des angeborenen Immunsystems in Krankheitsüberträgern Arten in der Hoffnung, von transgenen Mücken, die refraktär gegenüber solchen Pathogenen 1, 2 sind. Das angeborene Immunsystem der Moskitos besteht aus mehreren Zeilen Defense 3. Erreger, die die Barriere durch das Epithel ausgekleideten Moskito Mitteldarm 4 verhängten entkommen geben Sie die Hämolymphe und Begegnung zirkulierenden Blutzellen, wichtige zelluläre Komponenten kapseln und zu verschlingen Krankheitserreger 5, 6. Forscher haben keine Beweise für hämatopoetische Gewebe in Mücken gefunden und aktuelle Hinweise darauf, dass die Anzahl der Blutzellen bei Erwachsenen Entstehung ist fest und Zahlen können tatsächlich als die Mücke im Alter von 7 zurück. Die Fähigkeit, richtig zu sammeln und zu identifizieren Blutzellen von medizinisch wichtigen Insekten ist ein wesentlicher Schritt für das Studium der zellulären Immunität. Allerdings stellen die geringe Größe der Mücken und der begrenzten Volumen von Hämolymphe eine Herausforderung für das Sammeln Immunzellen.
Zwei etablierte Methoden für die Erfassung Mücke Blutzellen gehören Vertreibung der Hämolymphe von einem Schnitt Rüssel 8, und das Volumen Verschiebung (Perfusion), in der Salzlösung in die membranöse necklike Region zwischen dem Kopf und Thorax (dh, Gebärmutterhals) und der perfundierten Hämolymphe gesammelt injiziert aus einem zerrissenen Öffnung in einem distalen Bereich des Bauches 9, 10. Diese Techniken sind jedoch durch eine geringe Erholung der Blutzellen und mögliche Verunreinigungen durch Fett Körperzellen bzw. 11 begrenzt. In jüngerer Zeit eine Methode bezeichnet als hohe Einspritzdruck / Recovery verbesserte Rückgewinnung von Immunzellen durch die Verwendung von gerinnungshemmenden Puffer bei gleichzeitiger Reduzierung Ebenen kontaminierender Skalen und inneren Geweben 11. Während diese Methode ermöglicht ein verbessertes Verfahren zur Sammlung und Aufbewahrung Blutzellen für Primär-Kultur, bringt es eine Reihe von Einspritzung und Sammeln Schritte, die nicht notwendig sind, wenn der nachgeschaltete Ziel ist es, zu sammeln, zu fixieren und färben Blutzellen für die Diagnostik. Hier zeigen wir unsere Methode der Erhebung Moskito Hämolymphe, dass die Einfachheit der Durchblutung kombiniert mit gerinnungshemmenden Pufferlösungen anstelle von Kochsalzlösung, mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren.
Protocol
1. Vorbereitung im Vorfeld der hemocyte Sammlung
- Bereiten Sie eine Hämolymphe Verdünnungsmittel Lösung, die von 60% Schneider-Medium, 10% fötalem Rinderserum (FBS), und 30% Citratpuffer besteht (Antikoagulans, 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM Zitronensäure, pH 4,5) 11. Machen Sie 1,0 ml Aliquots, die bei -20 ° C gelagert werden können Verwenden Sie jedes Aliquot nur einmal (siehe Materialien).
- Bereiten Objektträger aus Glas (75 x 25 x 1 mm) durch Scoring ein 1 cm Durchmesser-Kreis an einem Ende mit einem Glas-Ätz-Tool. Alternativ können Objektträger mit zwei vorgeätzt Kreisen erworben (z. B. Fisher Scientific oder EMS Quellen) werden. Ein Glas Folie pro Moskito benötigt werden.
- Einen Satz von Glas-Nadeln (siehe Materialien) zog nach dem folgenden vorgeschlagenen Einstellungen (Sutter Instruments, Modell P-87):
Hitze Ramp 5 Pull: 45 Vel: 75 Zeit: 175 Pressure 580
Unter den empfohlenen Einstellungen auf dieser Abzieher, konstruieren wir Nadeln, die sich um 500 mm sind in der gesamten Länge mit Schaft Längen von ca. 3 mm. Pre-gezogen Nadeln können auch gekauft (zB Tritech Research) werden.
2. Vorbereitung der Mikroinjektor im Vorfeld der hemocyte Sammlung
- Legen Sie eine gezogen Nadel in die Mikroinjektor Nadelhalter nach den Anweisungen des Herstellers. Backfill die Mikroinjektor (siehe Materialien) Schlauch, Spritze und zog Glasnadel mit Mineralöl nach den Anweisungen des Herstellers.
3. Vorbereitung der weiblichen Mücken im Vorfeld der hemocyte Sammlung
- Saugen Sie 15 erwachsene Weibchen in kleine Massivkäfig Containern, die in Kontakt mit dem Eis werden können. Tauchen Käfig mit Stechmücken in Eis tief genug, so dass gesamte Höhe des Käfigs und alle Seiten sind in Kontakt mit dem Eis. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Mücken auf die Kälte ausgesetzt werden.
Kalte betäuben Mücken für ca. 8 Minuten oder bis sie nicht mehr mobil. - Legen Sie eine Mücke auf eine Depression gleiten. Diese Folie wird als Standort für Injektionen dienen.
4. Hemocyte Sammlung
- Stellen Sie die Mikroinjektor aufnehmen 12 ul Hämolymphe Verdünnungsmittel in gezapftes Nadel und Injektion Lösung in der Mücke zwischen der siebten und achten Abdominalsegmente. Etwa 3 Mücken können mit 3-3,5 ul der insgesamt 12 ul Volumen aufgenommen injiziert werden. Die Mücke sollte vorsichtig vorhanden sein, mit einer Pinzette gehalten, während Injektion durchgeführt wird. Ein kleines Volumen des Lösungsmittels sollte an der Spitze der Nadel bleiben, so dass Mineralöl aus der Injektion zu verhindern. Nach der Injektion der Bauch aussehen sollte "gefüllt" oder aufgedunsen.
- Legen Sie injizierten Moskitos in einem separaten sauberen Behälter auf Eis für 5 min zu erholen. Die Inkubationszeit des Antikoagulans Verdünnungslösung innerhalb der Mücke wird dazu beitragen, zu vertreiben Haemocyten Einhaltung interner Gewebe. Im Durchschnitt 3 bis 5 frische Mücken können während jeweils 5 min Erholungszeit injiziert werden.
- Nach 5 Minuten der Erholung, snip off Beine, Flügel und die Spitze des Bauches (an der achten Segment) jeder Mücke ein zu einer Zeit mit Mikro Schere. Dies sollte in der Erholung Tasse auf Eis gelegt, durchgeführt werden. Das Abschneiden der Beine und Flügel reduziert die Wahrscheinlichkeit von Skalen wird die Sammlung Dias übertragen. Achtung: nicht die Beine abgeschnitten und Flügeln zu nah an Brust-Bindungsstellen in der Nähe, oder Sie das Risiko einer weiteren Öffnungen für Hämolymphe zu entkommen. Hämolymphe sollte nur durch die Öffnung an der Spitze des Bauches geschaffen gesammelt werden.
- Wash ein Glas geätzt Objektträger mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit einem Kimwipe. Positionieren Sie eine injiziert und Mücke wieder auf der Folie auf dem äußeren Rand der geätzten Kreis. Set Mikroinjektor abholen 12 ul frisches Hämolymphe Verdünnungsmittel und injizieren dieses Volumen in der Mücke in der lateralen Seite der Mesothorax. Deliver meisten, aber nicht das gesamte Volumen des Lösungsmittels (ca. 8 bis 10 ul), so dass Mineralöl aus der Injektion zu verhindern. Ein kleines Volumen des Lösungsmittels sollte an der Spitze der Nadel bleiben.
- Position der Mücke, so dass der Schnitt abdominale Öffnung am Rand der 1-cm-Kreis ist. Nach der Injektion der verdünnten Hämolymphe sollte innerhalb der markierten Fläche gesammelt werden. Sobald die Nadel aus der mesothoracic Injektionsstelle entfernt wird, wieder hält der Mücke zwischen den beiden Armen der Zange und drücken Sie leicht den Bauch mit den Zangen der Hämolymphe auf die geätzte Kreisfläche zu lenken.
- Lassen verdünnt Hämolymphe auf Folie für ca. 10 Minuten oder bis sie sichtbar trocken trocken.
5. Hemocyte Fixierung und Färbung
- Stain jede Folie einzeln mit HEMA3 7 (siehe Materialien): Dip slide in Fixativ 5 Mal für jeweils 1 Sekunde Zeit, Dipslide in Lösung, die ich 3 mal für jeweils 1 Sekunde, und schließlich, dip slide in Lösung II 3-mal für jeweils 1 Sekunde. Spülen Sie die Rückseite der Folie mit DI-Wasser. Die Vorderseite der Folie sollte nicht gespült werden. Blot-dry der Vorderseite der Folie außerhalb geätzt Kreis mit gefärbten Gewebeschnitten.
- Bewerben Eindeckmedium (z. B. Shur / Mount oder Polymount) rund um die geätzten Zentrum und Ort ein Deckglas darauf. Drücken Sie leicht auf das Deckglas (25 x 25 mm), so dass die Montage Medium breitet sich der gesamte Bereich durch das Deckglas (einschließlich geätzt Kreis mit gefärbten Gewebeschnitten) abgedeckt. Lassen Sie die Objektträger für mindestens 3 Stunden oder über Nacht trocknen lassen. Blutzellen sollten innerhalb von 2 Wochen nach der Entnahme für eine optimale Visualisierung und Bildgebung betrachtet werden.
6. Repräsentative Ergebnisse
Beispiele für feste und HEMA3 gefärbten Blutzellen aus einer Aedes aegypti erwachsenen weiblichen gesammelt sind in Abbildung 1A-C gezeigt. Abbildung 1A zeigt eine hemocyte, dass wir als prohemocyte auf seine geringe Größe, kugelig-runde Form und hohe nukleare um Zytoplasma-Verhältnis (550x Vergrößerung) 11 Basis identifiziert. Abbildung 1B zeigt eine hemocyte als oenocytoid auf seiner Kugelform und hohe Zytoplasma der nuklearen Verhältnis (550x Vergrößerung) klassifiziert. Schließlich zeigt Abbildung 1C ein Granulozyten-type hemocyte (550x Vergrößerung). Granulozyten sind detailliertere in der Natur und sind eher amöboiden in Gestalt und Verhalten als sie sich an Glasflächen. Mit bisher veröffentlichten Kriterien für hemocyte Eingabe-und Recovery-11, ergab unsere Sammlung Methode eine ähnliche Zahl von insgesamt Blutzellen und wir ebenfalls festgestellt, dass Granulozyten bilden den größten Anteil der insgesamt Haemocyten 11 (Abb. 2).
Abbildung 1. Lichtmikroskopische Aufnahmen einer repräsentativen HEMA3 fixiert, gefärbt prohemocyte (A), oenocytoid (B) und Granulozyten (C) aus einer Ae. aegypti erwachsenen Weibchen. C = Cytoplasma, N = Kern G = Granulat.
Abbildung 2. Insgesamt zählt ± SE aller Blutzellen und Granulozyten pro Weibchen Mücke durch unsere Hämolymphe Verdünnung und Erhebungsmethode erhalten.
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Discussion
Die hemocyte Sammlung hier beschriebene Methode ist aus bisher publizierten Methoden modifiziert und erlaubt es, saubere Vorbereitung der Blutzellen von Aedes Moskitos mit weniger Schritten zu isolieren. Während unser besonderes Interesse liegt in der Charakterisierung hemocyte Populationen in Aedes Mücken, glauben wir, diese Technik auf andere Mücke Gruppen angewendet werden kann, nachdem erste Versuche durchgeführt werden, um eine ordnungsgemäße Injektionsvolumina zu bestimmen. Unser Protokoll verwendet Antikoagulans Pufferlösungen anstelle von Kochsalzlösung und liefert eine Population von Blutzellen, der exakt die Zahlen in vivo. Allerdings haben wir noch nicht die Eignung unserer Protokoll für die Aufrechterhaltung der isolierten Blutzellen in Kultur bestimmt.
Sammlung von Hämolymphe über einen Schnitt Rüssel hat sich gezeigt, dass die geringste Anzahl von zirkulierenden Blutzellen Ertrag und wird hier nicht weiter diskutiert werden. Perfusion-basierte Methoden, während leicht zu führen, haben für ein größeres Maß an Verunreinigung von inneren Geweben und Schuppen 11 kritisiert worden. Kürzlich wurden hohe Einspritzdruck / Recovery-Methoden entwickelt, um die Beitreibung Blutzellen zu verbessern, bei gleichzeitiger Reduzierung Ebenen der Verschmutzung von 11, aber bringt eine Reihe von Einspritzung und Sammeln Schritte. Unser Protokoll erhalten das gleiche Maß an erholte Blutzellen und reduziert Schadstoffe, aber mit weniger Injektion und das Sammeln Schritte und bietet damit eine einfache, aber genaue Methode, um saubere Vorbereitung der Blutzellen zu erhalten. Zunächst der einfache Schritt in unserem Protokoll zu entfernen Beine, Flügel und die Spitze des Bauches in einem Behälter getrennt von denen Hämolymphe wird Ergebnisse in viel sauberer Zubereitungen der Blutzellen gesammelt. Zweitens, unsere Methode Gewinne Genauigkeit durch die Verwendung Glasnadeln in einem Nadelhalter an einem Positive-Displacement Mikroinjektor statt. Während Verdünnungsmittel können ebenfalls injiziert mit Hand-Nadeln oder andere Hand-Delivery Devices, eines Mikroinjektor Einsatz erhöht die Genauigkeit der Fördermenge und anschließend Ergebnisse in Einklang Volumen des gesammelten Hämolymphe. Unsere Studien zeigen, dass kombinierte Injektionsvolumina von 9,5 bis 10,5 ul (Schritte 4.1 und 4.4) erlaubt es uns, konsequent zu sammeln 9-10 ul der Hämolymphe von injizierten weiblichen Mücken (unveröffentlichte Daten), wodurch eine weitere Maßnahme der Konsistenz bei der Quantifizierung hemocyte Populationen. Unsere Methode vereinfacht gesamte Kollektion, indem die Notwendigkeit für andere Hand-Injektionsnadeln und / oder Glaskapillaren verdünnt Hämolymphe zu sammeln.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Autoren möchten John Frey und Ben Peterson für Moskito Aufzucht danken. Wir danken auch Christine Davis und Gary Radice für die Hilfe bei hemocyte Aufnahmen. Diese Arbeit wurde von der University of Richmond Arts & Science Sommer Stipendium für AA Qayum und Dozenten zu gewähren A. Telang finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
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