Summary
A simplificada ainda método preciso para coletar e mancha hemócitos mosquito é descrito. Nosso método combina a simplicidade de perfusão com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes. Este método facilita os estudos que exigem conhecimento dos tipos de hemócitos e sua abundância.
Abstract
Os mosquitos são vetores de uma série de patógenos causadores de doenças como o vírus da febre amarela, malária e parasitas worms filarial. Laboratórios estão investigando anti-patógeno componentes do sistema imune inato na espécie dos vectores de doenças, na esperança de gerar mosquitos transgênicos que são refratários à patógenos, 1, 2. O sistema imune inato de mosquitos consiste de vários mecanismos de defesa 3. Patógenos que conseguem escapar da barreira imposta pelo mosquito epitélio do intestino médio-lined 4 entrar na hemolinfa e encontrar hemócitos circulantes, importantes componentes celulares que sintetizam e patógenos engulf 5, 6. Os pesquisadores não encontraram evidências de tecido hematopoiético em mosquitos e evidência atual sugere que o número de hemócitos é fixada em emergência de adultos e os números podem realmente diminuir com a idade mosquito 7. A habilidade para recolher e identificar hemócitos de insetos de importância médica é um passo essencial para os estudos da imunidade celular. No entanto, o pequeno tamanho dos mosquitos e do volume limitado de hemolinfa representam um desafio para coleta de células do sistema imunológico.
Dois métodos estabelecidos para a recolha de hemócitos mosquito incluem a expulsão de hemolinfa a partir de uma tromba de corte 8, e deslocamento de volume (perfusão), em que solução salina é injetada na região membranosa necklike entre a cabeça eo tórax (ie, colo do útero) ea hemolinfa perfundidos é coletada a partir de uma abertura rasgada em uma região distal do abdômen 9, 10. Estas técnicas, no entanto, são limitados pela baixa recuperação de hemócitos e possível contaminação por células de gordura corporal, respectivamente 11. Mais recentemente, um método conhecido como recuperação de injecção / alta recuperação melhorada de imunócitos pelo uso de buffers anticoagulante, reduzindo os níveis de escalas de contaminantes e tecidos internos 11. Enquanto que o método permite um método melhorado de coleta e manutenção hemócitos para cultura primária, envolve uma série de injeção e as etapas de coleta que não são necessárias se o objetivo é coletar a jusante, corrigir e mancha hemócitos para diagnósticos. Aqui, demonstramos o nosso método de coleta de hemolinfa mosquito que combina a simplicidade de perfusão, usando buffers anticoagulante em lugar de solução salina, com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes.
Protocol
1. Preparação antes da coleta de hemócitos
- Prepare uma solução diluente hemolinfa que consiste em 60% Medium Schneider, 10% de soro fetal bovino (FBS), e tampão citrato 30% (anticoagulante; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM de ácido cítrico, pH 4,5) 11. Faça alíquotas 1,0 mL que podem ser armazenadas a -20 ° C. Use cada alíquota apenas uma vez (veja Materiais).
- Prepare lâminas de vidro de microscópio (75 x 25 x 1 mm), marcando um círculo 1 cm de diâmetro em uma extremidade usando uma ferramenta de gravação de vidro. Alternativamente, lâminas de microscópio com dois pré-gravado círculos podem ser adquiridos (por exemplo, Fisher Scientific ou fontes EMS). Uma lâmina de vidro por mosquito serão necessários.
- Preparar um conjunto de agulhas de vidro (veja Materiais) puxou de acordo com as seguintes configurações sugeridas (Sutter Instruments, modelo P-87):
Rampa de calor 5 Pull: 45 Vel: 75 Tempo: 175 Pressão 580
Usando as configurações sugeridas nesta extrator, construímos agulhas que são em torno de 500 mm de comprimento com comprimentos de haste de cerca de 3 mm. Pré-puxado agulhas também podem ser adquiridos (por exemplo, Tritech Research).
2. Preparação de microinjetor antes da coleta de hemócitos
- Inserir uma agulha puxado para dentro do porta-agulha microinjetor de acordo com instruções do fabricante. Aterrar a microinjetor tubulação (veja Materiais), seringa e puxou agulha de vidro com óleo mineral de acordo com instruções do fabricante.
3. Preparação de mosquitos fêmeas antes da coleta de hemócitos
- Aspirar 15 fêmeas adultas em pequenos recipientes gaiola sólido que pode estar em contato com gelo. Mergulhe gaiola com os mosquitos no gelo a uma profundidade suficiente para que a altura total da gaiola e todos os lados estão em contato com gelo. Isso irá garantir que todos os mosquitos serão expostos ao frio.
Mosquitos frio anestesiar por cerca de 8 minutos ou até que eles não são mais móveis. - Coloque um mosquito em uma corrediça de depressão. Este slide servirá como local para injectáveis.
4. Coleta de hemócitos
- Definir o microinjetor para assumir 12 mL de diluente hemolinfa em agulha de vidro puxado e injectar a solução para o mosquito entre o sétimo e oitavo segmentos abdominais. Cerca de 3 mosquitos pode ser injetado com 3-3,5 mL do volume total de 12 mL retomada. O mosquito deve ser cuidadosamente mantidos no lugar com uma pinça, enquanto a injeção é realizada. Um pequeno volume de diluente deve permanecer na ponta da agulha, de modo a evitar que o óleo mineral de ser injetado. Após a injeção do abdômen deve olhar "cheio" ou inchado.
- Lugar injetado mosquitos em um recipiente separado limpa no gelo para recuperar por 5 min. A incubação da solução diluente anticoagulante dentro do mosquito irá ajudar a expelir hemócitos aderindo ao tecido interno. Em média 3-5 mosquitos fresco pode ser injetado em cada período de recuperação de 5 min.
- Após 5 minutos de snip de recuperação, as pernas, asas, ea ponta do abdômen (no oitavo segmento) de cada um mosquito em um tempo usando uma tesoura micro. Isto deve ser feito no copo de recuperação colocados no gelo. Cortar as pernas e as asas reduz a probabilidade de escalas de ser transferido para slides coleção. Nota: não corte as pernas e asas muito perto de locais de fixação torácica ou você corre o risco de criar outras aberturas para a hemolinfa para escapar. Hemolinfa só deve ser recolhida através da abertura criada na ponta do abdome.
- Lavar um copo lâmina de microscópio gravado com etanol 70% e seque com um kimwipe. Uma posição e recuperou mosquito injetado na lâmina na borda externa do círculo gravado. Definir microinjetor pegar 12 mL de diluente hemolinfa fresca e injetar este volume para o mosquito na lateral de sua mesotórax. Entregar a maior parte mas não todo o volume do solvente (aproximadamente 8 - 10 ml), de modo a evitar que o óleo mineral de ser injetado. Um pequeno volume de diluente deve permanecer na ponta da agulha.
- Posição do mosquito para que a abertura do corte abdominal está na borda do círculo de 1 cm. Após a injeção da hemolinfa diluída deve ser coletado dentro da área marcada. Uma vez que a agulha é removida do local da injeção mesothoracic, retomar segurando o mosquito entre os dois ramos da pinça e esprema delicadamente o abdômen com os fórceps para dirigir a hemolinfa para a área do círculo gravado.
- Permitir hemolinfa diluída para secar no slide por aproximadamente 10 minutos ou até que seja visivelmente seca.
5. Hemócitos fixação e coloração
- Mancha cada slide separadamente com HEMA3 7 (ver Materiais): Dip slide em fixador 5 vezes por 1 segundo a cada vez; Dipslide em solução I 3 vezes por 1 segundo cada e, finalmente, mergulhar slide na solução II 3 vezes por 1 segundo cada. Lavar a parte de trás da lâmina com água DI. A frente do slide não deve ser lavado. Blot-seco na frente do slide fora do círculo gravado contendo tecido manchado.
- Aplique meio de montagem (por exemplo, Shur / Mount ou Polymount) em torno do centro gravado e coloque uma lamínula sobre ele. Pressione levemente para a lamínula (25 x 25 mm), para que a montagem spreads médios para toda a área coberta pela lamínula (incluindo círculo gravado contendo tecido manchado). Permitir que as lâminas secar por no mínimo 3 horas ou durante a noite. Hemócitos deve ser visto dentro de 2 semanas após a colheita para a visualização ideal e de imagem.
6. Resultados representante
Exemplos de fixo e HEMA3 hemócitos manchada coletados de uma fêmea Aedes aegypti adulto são mostrados na Figura 1A-C. Figura 1A mostra um hemócitos que identificamos como um prohemocyte com base em seu pequeno tamanho, forma esférica-esferoidal e alta nuclear a relação citoplasma (550x de ampliação) 11. A Figura 1B mostra um hemócitos classificado como um oenocytoid com base em sua forma esferoidal e citoplasma elevada relação nuclear (550x de ampliação). Por fim, a Figura 1C mostra uma hemócitos de granulócitos-tipo (550x de ampliação). Granulócitos são mais granular na natureza e tendem a ser mais amoeboid em forma e comportamento como aderem a superfícies de vidro. Usando critérios publicados anteriormente para a digitação hemócitos e recuperação de 11, o nosso método de coleta rendeu um número similar de hemócitos total e nós também descobriram que os granulócitos constituem a maior porcentagem de hemócitos total de 11 (Fig. 2).
Figura 1. Imagens de microscópio de luz de um representante HEMA3 prohemocyte, fixo coradas (A), oenocytoid (B) e granulócitos (C) de um Ae. aegypti fêmea adulta. C = citoplasma, N = G = núcleo grânulos.
Figura 2. Contagens totais ± SE de todos os hemócitos e granulócitos obtidos por mosquito fêmea pelos nossos diluição hemolinfa e método de coleta.
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Discussion
O método de coleta de hemócitos aqui descrita é modificada a partir de métodos publicados anteriormente e permite isolar os preparativos limpa de hemócitos de Aedes mosquitos com menos etapas. Enquanto o nosso interesse particular reside na caracterização de populações de hemócitos em mosquitos Aedes, acreditamos que esta técnica pode ser aplicada a grupos mosquito outros após testes iniciais são realizados para determinar volumes de injeção adequada. Nosso protocolo utiliza buffers anticoagulante em lugar de solução salina e produz uma população de hemócitos que reflete com precisão os números in vivo. No entanto, nós ainda não determinaram a adequação do nosso protocolo para a manutenção de hemócitos isoladas em cultura.
Coleta de hemolinfa através de uma tromba de corte tem sido mostrado para produzir o menor número de hemócitos circulantes e não vai ser discutido aqui. Perfusão com base em métodos, enquanto fácil de conduzir, tem sido criticado por permitir um maior nível de contaminação de tecidos internos e escalas 11. Recentemente, alta injeção / recuperação métodos foram desenvolvidos para melhorar a recuperação de hemócitos, enquanto a redução dos níveis de contaminantes 11, mas implica uma série de injeção e as etapas de coleta. Nosso protocolo obtido o mesmo nível de hemócitos recuperado e contaminantes reduzido, mas com menos de injeção e as etapas de coleta, oferecendo assim um método simples, mas precisa obter preparações limpa de hemócitos. Primeiro, o simples passo em nosso protocolo de pernas remoção, as asas ea ponta do abdome em um recipiente separado, de onde é coletado hemolinfa resultados em preparações muito mais limpa de hemócitos. Em segundo lugar, nosso método de precisão, utilizando agulhas ganhos de vidro realizada em um suporte de agulha acoplada a um microinjetor de deslocamento positivo. Enquanto diluente pode também ser injetado usando hand-held agulhas ou outros dispositivos de mão fornecimento, a utilização de um microinjetor aumenta a precisão do volume de entrega e, posteriormente, resulta em volume consistente de hemolinfa coletadas. Nossos testes indicam que os volumes de injeção combinada de 9,5-10,5 mL (passos 4.1 e 4.4) nos permitiu recolher consistentemente 90-10 mL de hemolinfa de mosquitos fêmeas injetadas (dados não publicados), fornecendo assim outra medida de consistência na quantificação de hemócitos populações. Nosso método simplifica a cobrança geral removendo a necessidade de outras agulhas de mão de injeção e / ou tubos capilares de vidro para coletar hemolinfa diluída.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Autores gostariam de agradecer a John Frey e Ben Peterson para a criação de mosquito. Agradecemos também a Christine e Gary Davis Radice para ajudar com micrografias hemócitos. Esta pesquisa foi financiada pela Universidade de Richmond Artes e comunhão de verão Ciência para AA Qayum e conceder faculdade de A. Telang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
