Summary
Une méthode précise encore simplifiée pour collecter et tacher hémocytes de moustique est décrite. Notre méthode combine la simplicité de la perfusion avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes. Cette méthode facilite la connaissance des études nécessitant des types d'hémocytes et leur abondance.
Abstract
Les moustiques sont vecteurs d'un certain nombre d'agents pathogènes comme le virus de la fièvre jaune, les parasites du paludisme et de filaires. Les laboratoires sont enquêter anti-pathogènes des composants du système immunitaire inné des espèces vecteurs de maladies dans l'espoir de générer des moustiques transgéniques qui sont réfractaires aux agents pathogènes comme 1, 2. Le système immunitaire inné des moustiques se compose de plusieurs lignes de défense 3. Les pathogènes qui parviennent à échapper à la barrière imposée par le moustique épithélium bordée intestin 4 Entrez l'hémolymphe et de rencontre hémocytes circulant, d'importants composants cellulaires et les pathogènes qui encapsulent engloutir 5, 6. Les chercheurs n'ont pas trouvé de preuves pour les tissus hématopoïétiques chez les moustiques et les preuves actuelles suggèrent que le nombre d'hémocytes est fixé à l'émergence des adultes et des numéros peuvent en fait diminuer à mesure que l'âge des moustiques 7. La capacité à percevoir et identifier les hémocytes d'insectes d'importance médicale est une étape essentielle pour les études de l'immunité cellulaire. Cependant, la petite taille des moustiques et du volume limité d'hémolymphe posent un défi à la collecte de cellules immunitaires.
Deux méthodes établies pour la collecte des moustiques hémocytes notamment l'expulsion de l'hémolymphe d'une coupe proboscis 8, et le déplacement de volume (perfusion), dans lequel une solution saline est injectée dans la région membraneuse necklike entre la tête et du thorax (c'est à dire, du col utérin) et l'hémolymphe perfusés sont collectées d'une ouverture déchirée dans une région distale de l'abdomen 9, 10. Ces techniques sont cependant limitées par faible récupération des hémocytes et une possible contamination par des cellules de graisse du corps, respectivement 11. Plus récemment, une méthode appelée injection haute / Récupération améliorée d'immunocytes par l'utilisation de tampons anti-coagulant, tout en réduisant les niveaux d'échelles et de contaminer les tissus internes 11. Bien que cette méthode permet une meilleure méthode de collecte et de conservation hémocytes pour la culture primaire, il comporte un certain nombre d'injection et les étapes de collecte qui ne sont pas nécessaires si l'objectif est de recueillir l'aval, fixer et colorer hémocytes pour les diagnostics. Ici, nous démontrons notre méthode de collecte des moustiques hémolymphe qui allie la simplicité de la perfusion, l'aide de tampons anticoagulant en place d'une solution saline, avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes.
Protocol
1. Préparation à l'avance de la collecte hémocytes
- Préparer une solution de diluant hémolymphe qui se compose de moyennes de 60% de Schneider, 10% de sérum fœtal bovin (FBS), et un tampon de citrate 30% (anticoagulant, 98 mM de NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM d'acide citrique, pH 4,5) 11. Faire aliquotes de 1,0 mL qui peut être stocké à -20 ° C. Utiliser chaque aliquote qu'une seule fois (voir matériaux).
- Préparer des lames de microscope en verre (75 x 25 x 1 mm) en marquant un cercle de 1 cm de diamètre à une extrémité à l'aide d'un outil de verre gravure. Alternativement, des lames de microscope avec deux pré-gravé cercles peuvent être achetés (p. ex Fisher Scientific ou sources SME). Une lame de verre par moustique seront nécessaires.
- Préparer un ensemble d'aiguilles de verre (voir Matériaux) tiré selon les paramètres suivants suggéré (Sutter Instruments, modèle P-87):
Rampe de chaleur 5 Pull: 45 Vel: 75 Temps: 175 Pression 580
En utilisant les paramètres proposés sur ce extracteur, nous construisons des aiguilles qui sont autour de 500 mm de longueur hors tout avec des longueurs de tige d'environ 3 mm. Pré-tiré aiguilles peuvent également être achetés (p. ex Tritech recherche).
2. Préparation de microinjecteur avant la collecte des hémocytes
- Insérer une aiguille tirée dans le porte-aiguille microinjecteur conformément aux instructions du fabricant. Remblayer la microinjecteur (voir Matériaux) tubulure, seringue et l'aiguille tiré en verre avec de l'huile minérale selon les instructions du fabricant.
3. Préparation des moustiques femelles avant la collecte des hémocytes
- Aspirer 15 femelles adultes dans de petits contenants en cage solide qui peut être en contact avec la glace. Plongez en cage avec les moustiques dans la glace assez profond pour que toute la hauteur de la cage et tous les côtés sont en contact avec la glace. Cela permettra d'assurer que tous les moustiques seront exposées au froid.
Froid moustiques anesthésier pendant environ 8 minutes ou jusqu'à ce qu'ils ne sont plus mobiles. - Placer un moustique sur une lame de dépression. Cette diapositive servira du site pour les injections.
4. La collecte hémocytaires
- Réglez le microinjecteur à prendre en hausse de 12 ul de diluant dans l'hémolymphe aiguille de verre tiré et injecter la solution dans le moustique entre les septième et huitième segments abdominaux. Environ 3 moustiques peut être injecté avec 3 à 3,5 ul du total du volume 12 ul repris. Le moustique devrait être maintenu en place délicatement avec une pince tandis que l'injection est réalisée. Un petit volume de diluant doit rester à la pointe de l'aiguille afin d'éviter que l'huile minérale d'être injecté. Après l'injection de l'abdomen devrait ressembler "rempli" ou de ballonnement.
- Placez injecté moustiques dans un récipient séparé propre sur la glace pour récupérer pendant 5 min. L'incubation de la solution de diluant anticoagulant à l'intérieur du moustique aider à déloger les hémocytes adhérant aux tissus internes. En moyenne 3 à 5 moustiques frais peut être injecté au cours de chaque période de 5 min de récupération.
- Après 5 minutes de récupération, couper les jambes, les ailes et l'extrémité de l'abdomen (à la huitième segment) de chacun des moustiques à un moment à l'aide des ciseaux micro. Cela devrait être fait dans la coupe de récupération placé sur la glace. Couper les cuisses et les ailes réduit la probabilité d'échelles d'être transféré à diapositives collection. Remarque: ne pas couper les jambes et les ailes trop près des sites de fixation thoracique ou vous risquez de créer d'autres ouvertures pour l'hémolymphe de s'échapper. Hémolymphe ne devraient être collectées par l'ouverture créée à l'extrémité de l'abdomen.
- Laver une lame de microscope en verre gravé à l'éthanol 70% et le sécher avec un Kimwipe. Une position injecté et récupéré les moustiques sur la lame sur le bord extérieur du cercle gravé. Réglez microinjecteur pour ramasser 12 ul de diluant hémolymphe frais et injecter ce volume dans le moustique dans la face latérale de son mésothorax. Livrer la plupart mais pas la totalité du volume de diluant (environ 8 - 10 ul) afin d'éviter que l'huile minérale d'être injecté. Un petit volume de diluant doit rester à la pointe de l'aiguille.
- Position du moustique afin que l'ouverture abdominale est coupé sur le bord du cercle de 1 cm. Après l'injection l'hémolymphe diluée doit être recueilli dans la zone marquée. Une fois que l'aiguille est retirée du site d'injection mesothoracic, reprendre la tenue du moustique entre les deux bras de la pince et presser doucement le ventre avec ces pinces pour diriger l'hémolymphe sur la zone de cercle gravé.
- Autoriser l'hémolymphe diluée à sécher sur la lame pendant environ 10 minutes ou jusqu'à ce qu'il soit visiblement sec.
5. Fixation et coloration hémocytaires
- Tache de chaque diapositive séparément avec HEMA3 7 (voir Matériaux): Dip slide dans un fixateur 5 fois pendant 1 seconde à chaque fois; Dipslide dans la solution I 3 fois pendant 1 seconde et, enfin, tremper dans une solution de glisser II 3 fois pendant 1 seconde chacun. Rincer à l'arrière de glisser à l'eau DI. L'avant de la lame ne doit pas être rincé. Blot-sec à l'avant de la diapositive en dehors du cercle gravé contenant des tissus colorés.
- Appliquer le milieu de montage (par exemple Shur / Mount ou Polymount) autour du centre gravé et placer une lamelle sur elle. Appuyez légèrement sur la lamelle (25 x 25 mm) de sorte que les écarts moyens de montage sur toute la zone couverte par la lamelle (y compris les cercles gravés contenant des tissus colorés). Laisser sécher pendant glisse un minimum de 3 heures ou jusqu'au lendemain. Hémocytes devrait être considérée dans les 2 semaines suivant la collecte pour la visualisation optimale et d'imagerie.
6. Les résultats représentatifs
Exemples de fixe et HEMA3 hémocytes teinté recueillies à partir d'une femelle Aedes aegypti adulte sont présentés dans la figure 1A-C. La figure 1A montre une hémocytes que nous avons identifié comme un prohemocyte fonction de sa taille, petite-sphériques sphéroïdal forme et nucléaires de haute activité à taux de cytoplasme (550x de grossissement) 11. Figure 1B montre une hémocytes classée comme une oenocytoid en fonction de sa forme sphéroïdale et le cytoplasme élevé par rapport au nucléaire (550x de grossissement). Enfin, la figure 1C montre une hémocytes granulocyte-type (550x de grossissement). Les granulocytes sont plus granulaires dans la nature et tendent à être plus en forme amiboïde et le comportement qu'ils adhèrent aux surfaces de verre. En utilisant les critères publiés précédemment pour le typage des hémocytes et de récupération 11, notre méthode de collecte a produit un nombre similaire de hémocytes total et nous avons même constaté que les granulocytes forment le plus grand pourcentage d'hémocytes total de 11 (figure 2).
Figure 1. Images de microscopie lumineuse d'un représentant HEMA3 fixe, prohemocyte teinté (A), oenocytoid (B), et des granulocytes (C) à partir d'un Ae. femelle adulte aegypti. C = cytoplasme, N = G = noyau de granulés.
Figure 2. Compte totale ± SE de tous les hémocytes et des granulocytes obtenus par moustique femelle par nos dilution hémolymphe et méthode de collecte.
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Discussion
La méthode de collecte hémocytes décrite ici est modifiée à partir des méthodes précédemment publiées et permet d'isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes avec moins d'étapes. Bien que notre intérêt particulier réside dans la caractérisation des populations hémocytaires moustiques du genre Aedes, nous pensons que cette technique peut être appliquée à des groupes de moustiques d'autres, après les premiers essais sont effectués pour déterminer les volumes d'injection. Notre protocole utilise des tampons anti-coagulant en place d'une solution saline et les rendements d'une population d'hémocytes qui reflète fidèlement le nombre in vivo. Cependant, nous n'avons pas encore déterminé pertinence de notre protocole pour le maintien de hémocytes isolés en culture.
Collection d'hémolymphe à travers une trompe coupée a été démontré que le rendement le plus petit nombre d'hémocytes circulants et ne sera pas examinée plus avant ici. Perfusion basée sur des méthodes, tandis que facile à réaliser, ont été critiqués pour permettre à un plus grand niveau de contamination des tissus internes et échelles 11. Récemment, l'injection haute / récupération méthodes ont été développées pour améliorer la récupération des hémocytes, tout en réduisant les niveaux de contaminants 11, mais comporte un certain nombre d'injection et les étapes de collecte. Notre protocole a obtenu le même niveau de hémocytes récupérés et les contaminants réduits mais avec moins d'injections et les étapes de collecte, offrant ainsi une méthode simple mais précis pour obtenir des préparations nettoyage des hémocytes. Premièrement, la simple étape dans notre protocole de jambes enlever, les ailes et l'extrémité de l'abdomen dans un récipient séparé de l'endroit où sont collectées les résultats hémolymphe dans les préparations beaucoup plus propre des hémocytes. Deuxièmement, notre méthode de gains de précision en utilisant des aiguilles de verre maintenues dans un porte-aiguille attachée à une microinjecteur volumétrique. Alors que diluant peut également être injecté à l'aide d'aiguilles à main ou autres dispositifs d'administration de main, utilisation d'un microinjecteur augmente la précision des volumes de livraison et la suite des résultats cohérents dans le volume d'hémolymphe recueillies. Nos essais indiquent que les volumes d'injection combinée de 9,5 à 10,5 ul (étapes 4.1 et 4.4) nous a permis de collecter systématiquement 90-10 ul d'hémolymphe d'injecter les moustiques femelles (données non publiées), fournissant ainsi une autre mesure de la cohérence dans la quantification des populations hémocytaires. Notre méthode simplifie la collecte globale en supprimant la nécessité pour les aiguilles d'injection à main et / ou des tubes capillaires en verre pour recueillir hémolymphe diluée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Auteurs tiens à remercier John Frey et Ben Peterson pour l'élevage de moustiques. Nous remercions également Christine Davis et Gary Radice de l'aide pour micrographies hémocytaires. Cette recherche a été financée par l'Université de Richmond Arts & Sciences bourse d'été aux AA et les professeurs Qayum accorder à A. Telang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
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