Summary
התרבות של תאים נורמליים בהקשר שלהם תלת ממדי מייצג שיטה חלופית לחקור אירועים מוקדם נדרש שינוי tumorigenesis הסלולר. שיטה זו משמשת לגדול השחלות נורמלי תאים oviductal ללמוד האירועים מוקדם להיווצרות סרטן השחלות.
Abstract
סרטן השחלות הוא הגורם המוביל החמישי של מקרי מוות מסרטן בקרב נשים יש שיעור תמותה 63% בארצות הברית 1. סוג תא המוצא עבור סרטן השחלות עדיין השאלה יכול להיות גם על פני השחלות אפיתל (OSE) או אפיתל דיסטלי של fimbriae את החצוצרה 2,3. Culturing תאים נורמליים כתרבות ראשוני במבחנה יאפשר למדענים מודל שינויים ספציפיים שעשויים לגרום לסרטן השחלות האפיתל ברורים, ובכך לקבוע בוודאות את סוג התא המוצא. זה יאפשר פיתוח של סמנים ביולוגיים יותר מדויק, במודלים של בעלי חיים עם ספציפיים רקמות שינויים גן, אסטרטגיות מניעה טובה יותר ממוקד המחלה.
שמירה על תאים נורמליים הידרוג אלגינט לטווח קצר מקדמת תרבות של תאים במבחנה בהקשר שלהם תלת מימדי ומאפשרת המבוא של ה-DNA פלסמיד siRNA, ומולקולות קטנות. על ידי איברים culturing לחתיכות כי הם שנבעו מקיצוצים אסטרטגי באמצעות אזמל, תרבויות מספר מאיבר אחד יכול להיות שנוצר, הגדלת מספר ניסויים מבעל חיים אחד. קיצוצים אלו היבטים מודל הביוץ מוביל לשגשוג של OSE, אשר מזוהה עם היווצרות סרטן השחלות. סוגי תאים כגון OSE כי אינם גדלים היטב על משטחי פלסטיק יכול להיות מתורבת בשיטה זו ולהקל על חקירת תהליכים תאיים רגיל או את האירועים המוקדמים להיווצרות סרטן 4.
הידרוג אלגינט יכול לשמש כדי לתמוך בצמיחה של סוגים רבים של רקמות 5. אלגינט הוא פוליסכריד ליניארי מורכב יחידות חוזרות של חומצת-D-mannuronic β ו α-L-guluronic חומצה שניתן crosslinked עם יוני סידן, וכתוצאה מכך פעולה gelling עדין שאינו נזק לרקמות 6,7. כמו אחרים תלת ממדי התרבות מטריצות תאים כגון Matrigel, אלגינט מספק תמיכה מכאנית עבור רקמות, אולם החלבונים אינם תגובתי עם המטריצה אלגינט, ולכן פונקציות אלגינט כמטריצה תאיים סינתטי שלא ליזום התא איתות 5. הידרוג אלגינט מרחפת בתווך תא רגיל התרבות תומך ארכיטקטורת הצמיחה רקמות במבחנה.
השיטה מוצגת להכנת, הפרדה, והטבעה של השחלות חתיכות איברים oviductal לתוך הידרוג אלגינט, אשר ניתן לשמור על תרבות של עד שבועיים. לשחרר האנזימטית של תאים לניתוח דגימות RNA חלבונים מן התרבות איבר מתואר גם. לבסוף, את הצמיחה של תאים מסוגים ראשוני ניתן ללא הנצחה גנטי מעכברים היתרי החוקרים להשתמש בנוקאאוט ואת העכברים הטרנסגניים.
Protocol
1. השחלות ביתור ובידוד רקמה
- הכן פתרון 0.5% (w / v) של אלגינט הנתרן, להכין מגירסה שונה של הפרוטוקול שתואר לעיל 5, באמצעות PBS סטרילית חום 37 ° C. מערבבים על ידי היפוך או נדנדה, אבל לא מערבולת. צייר את אלגינט לתוך מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G ולשמור על 37 ° C.
- הכן 10mm סטרילי CaCl 2 פתרון אלגינט crosslinking על אנקפסולציה רקמות חמים 37 ° C.
- הכן 1mL של המדיום תרבות (αMEM + 5 יחידות פניצילין 5 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) לכל היטב צלחת 24 היטב כל ניסוי. הכללת תרופות שונות, פפטידים, וירוסים או במדיום תרבות. עבור transfection לפני אנקפסולציה איברים, רקמות דגירה עם Lipofectamine 2000 ו-DNA פלסמיד במשך ארבע שעות בכל 37 ° C.
- מנתחים את האיברים מן החיה, להסיר את כל רקמת שומן או שיורית, משוך בעדינות את הממברנה בורסה המקיפה את השחלה, לחתוך את השחלה או oviduct לארבעה חלקים על ידי שחצתה את האיבר. החיות היו מורדמים בחנק CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. עבור oviduct, להשתחרר בעדינות את הרקמה על ידי משיכת לגזרים את הקרומים חיבור והארכת הקצוות של הצינור בכיוונים מנוגדים באמצעות מלקחיים לפני החיתוך.
- מניחים טיפה אחת אלגינט (~ μL 1-3) על סיב רשת מעוקרים.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר חתיכת איבר לתוך אגל אלגינט והמרכז אגל באמצעות מלקחיים או מחט סטרילית.
- היפוך אגל המכיל את חתיכת איבר (organoid) ידי אחיזה סיבים רשת עם מלקחיים סטריליות ולהפוך אותו הפוך, כדי לאפשר לכוח הכבידה אלגינט תוך ירידה תלוי.
- הקש על מלקחיים על קצה צלחת פטרי המכילה 10 ס"מ 10mm CaCl 2 פתרון, כך הירידה נופל לתוך פתרון.
- דגירה במשך 2 דקות, מוציאים בכף סטרילית המכילה נקבוביות לשחרר תוספת 10mm CaCl 2, ולהעביר את המדיום לתרבות. עד ארבעה ג'ל אלגינט ניתן להעביר לתוך הבאר אחד של צלחת המכילה 24 היטב את המדיום לתרבות. תרבות לתקופת זמן מוגדרת.
2. הפירוק של אלגינט אוסף של תאים
- עבור solubilization של ג'ל אלגינט, דגירה התרבויות lyase אלגינט (3.4 מ"ג / מ"ל) מומס L-15 של ליבוביץ התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד הג'ל נמס לחלוטין.
- הסרת רקמה lyase אלגינט.
- עבור אוסף של OSE, דגירה organoid עם 500 יחידות collagenase ב-L-15 של ליבוביץ התקשורת במשך שעה 1 8. וורטקס ב 2 פעימות השני (2 שניות מערבולת ו -2 שניות מנוחה) על כוח בינוני למשך דקה 1, ואחריו 1 פולסים השנייה (1 מערבולת השני 1 שאר השנייה) למשך דקה 1. בואו חתיכות איברים ליפול לתחתית של התחתית microcentrifuge ו supernatant פיפטה לתוך צינור טרי microcentrifuge סטרילית. צנטריפוגה 3 דקות ל 3000 סל"ד אפיתל פני השטח גלולה השחלות.
- עבור אוסף של האפיתל חצוצרות, לחתוך את הצינור לאורך ומניחים על ניילון רקמה תרבות DMEM עם 5 יחידות פניצילין 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו -4% (v / v) FBS. במשך 3-5 ימים, התאים יהיה "לזחול" מתוך stroma חצוצרות ולגדול על תרביות רקמה plastic9.
3. קיבוע של במארז אלגינט תרבויות איבר עבור חלקים פרפין
- אסוף את אלגינט במארז חרוז ממדיום התרבות בנקודת הזמן שנבחר.
- Recrosslink אלגינט כדי להקשיח את הג'ל על ידי הטלת התרבות לתוך סטרילי פתרון 10mm 2 CaCl במשך שתי דקות.
- תקן את איבר אלגינט הגלום paraformaldehyde 2% סוכרוז המכילה 50 מ"מ, 10 mM CaCl 2 ו 50 נתרן cacodylate mM על מנת להבטיח כי הג'ל נשאר מוצק מלא תמצית רקמות במהלך קיבעון.
- בעקבות עיבוד רקמות, להטביע את תרבות שלמה אלגינט, במארז איבר לתוך חתיכת פרפין קטע עם microtome לייצר 5 סעיפים מיקרומטר.
- אלגינט יפורק והוציאו משקופית אם ביצוע אימונוהיסטוכימיה עקב החום אחזור אנטיגן מבוסס. אלגינט תישאר כתם על eosin תחת עומד hematoxylin והכתים eosin.
4. נציג תוצאות:
דוגמה תרבות תלת מימדי איבר של השחלה ואת oviduct מוצג באיור 1. השחלות ניתן לחתוך לחתיכות בגודל שונה, OSE להתרבות ולהעביר לתקן את פני השטח כי נפצע מן החתך עם אזמל. במהלך תהליך זה, הכיוון הנכון של OSE ביחס stroma הבסיס נשמר, עם OSE encapsulating את השחלה. כפי שניתן לראות בתרשים 2, OSE של השחלות בחצי לתמצת את השחלה יותר לחלוטין לעומת השחלות לחתוך לרבעים או שמיניות. לתקן פצע של השחלותפני השטח ניתן ללמוד בהקשר של השחלה כולו עשוי לשפוך אור על איך לתקן את הביוץ פני השטח גורם לשינוי השחלות.
נקודת הסיום של הניסוי תלויה המידע הנדרש. האדריכלות רקמות, מורפולוגיה הסלולר, וספציפית שיעורי צמיחה הסלולר נמצאות תחת פיקוח בקלות באמצעות קטעים פרפין. לדוגמה, שכבה אחת של אפיתל פני השחלות הוא ציין לאחר culturing ב αMEM סרום ללא למשך 7 ימים (איור 3A) תוך תוספת של 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין למשך 7 ימים גורם hyperproliferation של אפיתל פני השחלות היווצרות של שכבות מרובות של התאים (איור 3B). על ידי הוספת bromodeoxyuridine לתרבויות בריכוז סופי של 10 מיקרומטר 24 שעות לפני קיבעון, התרבות התאים ניתן למדוד (3A הבלעה ו 3B). עבור תרבויות נשמר αMEM בסרום חינם, כ 3-5% מכלל OSE עוברים שגשוג בתקופת 24 שעות תיוג (3A הבלעה), ואילו אחוז גבוה יותר של תאים granulosa להתרבות. תוספת של אינסולין על תרבות התקשורת מגביר את אחוז מתרבים OSE על כ -30% מסך OSE (3B הבלעה). Immunofluorescence של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ניתן דמיינו באמצעות ג'ל אלגינט עם מיקרוסקופ רגיל הבאה transfection cDNA (איור 3 ג). בעוד איבר תרבות אלגינט מספקת לצמיחה וניתוח של אפיתל פני השחלות זקיקים ראשוניים, יש לציין כי בוגרת, זקיקים משניים מצליחים לשרוד במערכת זו תרבות (איור 3D). תרבות של זקיקים בודדים לפדיון בתוך המטריצה הידרוג אלגינט תוארה במקומות אחרים 10.
שינויים חלבון או רנ"א ניתן לנתח מן האיבר כולו או סוגי תאים מסוימים באמצעות פירוק אנזימטי (איור 4). טיפול organoids השחלות תרבותי עם collagenase עוזב את stroma הבסיסית שלמים (איור 4C) תוך מתן אפשרות להעשרה של OSE בתא גלולה שהושגו לאחר הטיפול, אם כי חלק מתאי סטרומה מבודדים גם (איור 4D).
1. השחלה איור עכבר תלת ממדי התרבות המערכת השתמשו כדי להפיץ OSE לאחר פציעה. א) תחת המיקרוסקופ, בורסה לבין כרית השומן המקיפים הוסרו. ב) השחלה אינטקט (O) עם צינור oviductal (T) ושומן כרית (F). ג) השחלות עם בורסה כרית השומן הוסר (משמאל) התיר oviduct (מימין). ד) organoids השחלות או oviductal הונחו לתוך אגל אלגינט. E) organoids אלגינט עטוף הוטלו לתוך crosslinking 2 CaCl הפתרון אלגינט כדי ליצור ג'ל. F) אלגינט במארז organoid השחלות. G) אלגינט במארז organoid oviductal. H) organoids אלגינט הגלום במדיום מודגרות תרבות.
איור 2. פני השטח מחדש על ידי השחלות לפני השטח נמדד על ידי cytokeratin 8. Encapsulation של organoids השחלות על ידי OSE לאחר וחותכים, רבעים שמיניות, ועל חצאים, בתרבית בינוני BSA, נמדד על ידי ניתוח immunohistochemical באמצעות cytokeratin 8 (CK8) נוגדן.
3. איור אלגינט מערכת התרבות מאפשר מעבר של גורמי גדילה transfection של cDNA לתוך OSE, אך אינו תומך צמיחה התבגרות מהירה של זקיקים. א) organoid השחלות בתרבית למשך 7 ימים במדיום הבסיסי ניתח עבור CK8 הביטוי, אשר מסמן את OSE. סעיף הבלעה, סידורי מוכתם עבור התאגדות BrdU. ב) תוספת של אינסולין התקשורת בתרבות גורם היפרפלזיה של OSE. סעיף הבלעה, סידורי מוכתם עבור התאגדות BrdU. ג) organoid השחלות transfected עם cDNA להביע את ה-GFP. ד) תרבות אלגינט מערכת תומכת צמיחה של זקיקים בראשיתי (חץ אדום), אבל לא משני זקיקים בשלים (חץ שחור).
איור 4. OSE ניתן לבודד לתרבות הניתוח הבא. א) Organoid בתרבית בינוני עד 2 שבועות. ב) organoid Encapsulated מטופל עם lyase אלגינט לעזוב organoid ללא פגע. השחלה היא מוכתמת CK8 לציון OSE. ג) Organoid מטופל עם collagenase אל OSE נפרד stroma הבסיסית. פיסת הרקמה נותרת היה מוכתם CK8 להדגיש הסרת פני השחלות. ד) לאחר הטיפול התאים שנאספו מועשרים עבור OSE כמו מוכתם עבור CK8 (אדום). תאים הם counterstained עם DAPI לציון גרעינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפיתוח של מערכת תלת מימדי איבר תרבות ניצול הידרוג אלגינט מייצג שיטה לניתוח תכליתי הרבה סוגי רקמות שונים ממגוון רחב של אורגניזמים. השימוש תרבויות 3D ניתן להרחיב בתחומי הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית כפי שהוא מספק פיגום שעליו התאים יכולים לגדול 11. נכון לעכשיו, במעבדה שלנו עוברת מחקרים ראשוניים באמצעות השחלות האדם רקמת החצוצרה, אך תרבות של זקיקים קוף אדם הלא אנושי תוארה 12,13.
השימוש הידרוג אלגינט כדי organoids התרבות מציע מספר יתרונות על פני סוגים אחרים של הידרוג, כגון קולגן אלו שילוב, הפיברין, או חומצה היאלורונית. ג'ל אלגינט בטמפרטורת החדר pH נייטרלי, מתן עבור הפרעה קטנה לרקמה כמו הג'ל תמצית 14 organoid. אלגינט אינו מגיב עם חלבונים תאיים, מתן תמיכה אינרטי מבחינה כימית לצמיחת רקמת 5. הג'ל ניתן enzymatically אלגינט מושפל lyase שימוש, אשר לא לבזות את רקמת כמוס, המאפשר שליפה של תאים בתרבית 15. חסרון אחד של השימוש הידרוג אלגינט לתרבות תלת ממדי רקמה היא crosslinking יוניים מתן תמיכה מכני הידרוג מאבד יציבות לאורך זמן, דבר המחייב תקופות תרבות מוגבל מחדש crosslinking של אלגינט לפני קיבוע 5. היבטים קריטיים של פרוטוקול זה שמירה על סטריליות בכל תהליך התרבות, כמו גם דיסקציה זהירה של השחלות לבין רקמת oviductal כדי למנוע שיבושים מורפולוגיה הרקמה.
השחלה ועל oviduct מתאימים במיוחד שיטה זו בגלל משטח השחלות אפיתל בתרבית על הפלסטיק בתא התרבות המסורתית במהירות עובר אפיתל המעבר mesenchymal, שינויים מורפולוגיים, ומוות התא אלא אם כן הנציח, למשל על ידי ביטוי של אנטיגן T / T SV40 או hTERT 16, 17. צמיחה Poor של OSE רגיל על הפלסטיק מעכבת ניתוח פוטנציאל טרום ממאירים שינויים. מערכת תרבות איבר תומך גם את הצמיחה של אפיתל פני השחלות או אפיתל oviductal במגע עם תאים סטרומה הבסיסית, אשר עשוי לשחק תפקיד הפיזיולוגיה הנורמלית וממאירים של cells18. תרבות מסוגי הרקמות הידרוג אלגינט מספק תמיכה מכאנית לשמור על ארכיטקטורה תלת ממדי של רקמה, ואילו הג'ל עצמו אינו אינטראקציה עם תאים 5.
באמצעות שיטה זו על פני השחלות אפיתל culturing או אפיתל oviductal מאפשר ניתוח של שינויים מורפולוגיים מולקולרית הנובע מניפולציות מבודדת של התרבות. מערכת הידרוג אלגינט מאפשר מעבר חופשי של siRNA transfected, cDNA, ו shRNA, כמו גם הורמונים, גורמי גדילה 19. בעוד transfection חולף אינו ספציפי עבור OSE, כי זה סוג התא על פני השטח החיצוני של יעילות transfection organoid הגבוהה מושגת OSE לעומת סוגי תאים אחרים בפנים של השחלה, כגון תאים granulosa. התאגדות של bromodeoxyuridine במהלך תקופת תוויות תרבות חלוקת התאים על ידי ניטור השינויים בצמיחת הסלולר בתגובה תנאי הניסוי. שינויים מולקולרית בבית RNA או רמת חלבון אז יכול להיות נחוש להבהיר מנגנוני מובילה לשינויים neoplastic.
בעוד האטיולוגיה המדויקת של סרטן השחלות אינו ידוע, מספר מוגבר של ovulations החיים היו במיתאם עם סיכון מוגבר לסרטן השחלה 20. בניתוח vivo של השערות קישור הביוץ כדי סרטן השחלות מציב אתגרים רבים בקביעת תרומתו של gonadotropins, שגשוג, ודלקת ל 21-23 סרטן. הידרוג אלגינט תרבות של השחלות oviducts מאפשר השוואה, מבודדות ישירה של כל אחד מהמרכיבים הללו האפיתל השחלות פני האפיתל oviductal, המוביל מידע חדש על מקור סרטן השחלות ההתקדמות שלה תאים נורמליים גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מחקר על סרטן השחלות קרן [מענק LT/UIC/01.2011], מרכז UIC למדע Translational קלינית, המרכז לסרטן UIC, לבין המכון הלאומי לבריאות מענק C06RR15482.
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי AAALAC תחת אושרה לטיפול בפרוטוקולים בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש ב UIC. בעלי חיים עבור פרויקט זה הם שוכנו בחדרים המכשול הביולוגי משאבי המעבדה (BRL) באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. BRL יש צוות וטרינרי מלא המנטרת בעלי חיים לפחות פעמיים ביום, ומספק עצות לטיפול בבעלי חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A.
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J.
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C.
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
