Summary
Üç boyutlu bağlamında normal hücreleri Kültür, hücresel dönüşüm ve tümörogenez için gerekli erken olayları incelemek için alternatif bir yöntem temsil eder. Bu yöntem, normal yumurtalık ve yumurtalık kanseri oluşumu erken olayları incelemek için oviductal hücreleri büyümek için kullanılır.
Abstract
Yumurtalık kanseri, kadınlarda kanser ölümlerinin beşinci önde gelen nedenidir ve Amerika Birleşik Devletleri 1% 63 ölüm oranına sahiptir . Over kanseri için menşe hücre tipi, söz konusu hala ya da over yüzey epitel (OSE) veya fallop tüpü fimbria 2,3 distal epitel olabilir. In vitro bir temel kültür olarak normal hücreleri Kültürleme, bilim adamları, böylece kesin olarak belirlenmesi, farklı epitel kökenli hücre tipi yumurtalık kanserine yol açabilir belirli değişiklikler modeline sağlayacaktır. Bu, bu hastalığın hedefleyen daha doğru biyobelirteçleri, doku spesifik gen değişiklikleri ile hayvan modellerinde ve daha iyi önleme stratejileri gelişimini sağlayacaktır.
Aljinat hidrojeller normal hücreleri korumak, kendi üç boyutlu bağlamında hücrelerin in vitro kültürü kısa vadeli teşvik ve plazmid DNA, siRNA ve küçük moleküllerin giriş izin verir. Tek bir hayvan deney sayısını artırarak, tek bir organ oluşturulabilir bir neşter, çeşitli kültürler ile stratejik kesimler türetilmiştir adet kültür organları tarafından. Bu OSE çoğalması, yumurtalık kanseri oluşumu ile ilgili önde gelen yumurtlama modeli yönlerini keser. Hücre tipleri, plastik yüzeylerde iyi büyümek değil OSE olarak bu yöntemi kullanarak kültürlü ve normal hücresel süreçler veya 4 kanser oluşumu ilk olaylar soruşturma kolaylaştırmak olabilir.
Aljinatta hidrojeller dokuların 5 birçok çeşit büyümeyi desteklemek için kullanılabilir. Aljinat zarar dokuların 6,7 nazik olmayan bir jelleşme eylem sonucunda, β-D-mannuronic asit ve kalsiyum iyonları ile çapraz bağlı olabilir α-L-guluronic asit birimleri tekrar oluşan lineer bir polisakkarit. Matrigel olarak diğer üç boyutlu hücre kültürü matrisler gibi, aljinat dokular için mekanik destek sağlar ancak, proteinler aljinat matris ile reaktif değildir ve bu nedenle hücre 5 sinyalizasyon başlatmak değildir sentetik ekstraselüler matriks olarak aljinat fonksiyonları. Aljinat hidrojel, standart hücre kültürü ortamında yüzer ve in vitro doku büyümesini mimarisini destekler .
Hazırlama, ayırma, yumurtalık ve oviductal organ parçaları, iki hafta kadar kültür muhafaza edilebilir aljinat hidrojeller, içine yerleştirilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Organ kültürü protein ve RNA örnekleri analiz için hücrelerin enzimatik sürümü de açıklanmıştır. Son olarak, birincil hücre tipleri büyüme, farelerin genetik ölümsüzleşme olmaksızın mümkün ve nakavt ve transgenik fareler kullanmak araştırmacılar izin verir.
Protocol
1. Yumurtalık diseksiyon ve doku yalıtımı
- % 0.5 'lik (w / v) sodyum aljinat çözeltisi hazırlayın, protokol değiştirilmiş bir versiyonu hazırlamak steril PBS ve 37 ısı ° C kullanarak, daha önce 5 açıklanan Inversiyon veya sallanan karıştırın, ancak girdap yok. 25 G iğne ile 1 ml şırınganın içine aljinat çizin ve 37 ° korumak ° C
- Crosslinking aljinat doku kapsülleme üzerine ve 37 sıcak ° C 10mM steril CaCl 2 çözüm hazırlayın
- 1 ml kültür vasatı (αMEM + 5 adet penisilin ve 5 mg / ml streptomisin) başına her bir deney için 24 plaka hazırlayın. Kültür ortamında çeşitli ilaçlar, peptidler, ya da virüsler ekleyin. Organı kapsülleme önce transfeksiyon için, 37 ° C'de dört saat için Lipofectamine 2000 ve plazmid DNA doku inkübe
- Hayvan organları teşrih, herhangi bir yağ ya da kalıntı doku kaldırmak, yumurtalık çevresindeki bursa membran yavaşça çekin ve organ bisecting dört adet yumurtalık veya yumurtalık kesmek. Hayvanlar servikal dislokasyon CO 2 boğulma tarafından ötenazi edildi. Boruların için, yavaşça bağlantı membranlar ayrı çekme ve zıt yönlerde kesmeden önce forseps kullanarak tüp biter uzanan doku çözmek.
- Steril bir örgü lif üzerine tek bir aljinat damlacık (~ 1-3 mcL) yerleştirin.
- Steril forseps kullanarak, organ aljinat damlacık ve merkezi forseps veya steril bir iğne kullanarak damlacık içine bir parça taşımak.
- Steril forseps ile örgü lif açgözlü ve yerçekimi asılı damla aljinat zorlamasına izin ters çevirerek organ parçası (organoid) içeren damlacık haricindekileri.
- Forseps 10cm petri açılan çözüm denk gelecek şekilde 10mM CaCl 2 çözüm içeren bir kenarına dokunun.
- 2 dakika boyunca inkübe, kültür ortamı içine ekstra 10mM CaCl 2, ve transfer serbest bırakmak için gözenekleri içeren steril kaşıkla çıkartın. 24 plaka kültür ortamı içeren tek bir kuyunun içine dört aljinat jeller transfer edilebilir. Kültür belirli bir süre için.
2. Aljinat ve toplama hücrelerin bozunması
- Aljinat jel çözünürleştirme için kültürler, 37 ° C'de 30 dakika kadar veya jel tamamen eriyene Leibovitz L-15 medya çözünmüş aljinat liaz (3.4 mg / ml) kuluçkaya yatmaktadır.
- Aljinat liaz doku çıkarın.
- OSE toplanması için, 500 adet 1 saat 8 Leibovitz L-15 medya kollajenaz organoid kuluçkaya yatmaktadır. Vortex, 1 dakika için 1 saniye bakliyat (1 saniye vorteks ve 1 saniye geri kalanı) takip 1 dakika orta güç 2 saniye bakliyat (2 saniye girdap ve 2 saniye dinlenin),. Organı adet taze, steril mikrosantrifüj tüpe mikrosantrifüj tüp ve pipet süpernatant altına düşebilir. Pelet over yüzey epitel 3000 rpm'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Tubal epitel toplanması için, 5 adet penisilin ve 5 mg / ml streptomisin ve% 4 (v / v) FBS DMEM doku kültürü plastik uzunlamasına tüp kesme ve yer. 3-5 gün içinde, hücreleri tubal stroma "tarama" ve doku kültürü plastic9 üzerinde büyümek.
3. Kesitler için aljinat kapsüllü organ kültürleri fiksasyonu
- Seçilen bir zaman noktasında kültür ortamı boncuk kapsüllü aljinat toplayın.
- Iki dakika süreyle steril 10mM CaCl 2 çözüm kültür bırakarak jel pekiştirmek için aljinat Recrosslink.
- Jel sağlam kalır ve sabitleme sırasında tamamen doku kapsüller sağlamak için% 2 paraformaldehid 50 mM sukroz, 10 mM CaCl 2 ve 50 mM sodyum cacodylate içeren aljinat kapsüllü organı sabitleyin.
- Takiben, doku işleme, parafin ve 5 mikron bölümleri oluşturmak için bir mikrotom bölüm içine tüm aljinat-kapsüllü organ kültürü parçası gömün.
- Aljinat çözünmüş ve ısı tabanlı antijen alımı nedeniyle immünohistokimya performans halinde slayt kaldırılır olacaktır. Aljinat hematoksilen ve eozin boyama ayakta altında kalır ve eozin leke.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Yumurtalık ve yumurtalık üç boyutlu organ kültürünün bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Yumurtalıklar farklı boyutta parçalar halinde kesilir ve OSE çoğalırlar ve bistüri ile kesi yaralandı yüzey tamir göç. Bu süreçte, temel stroma göre OSE doğru yönde yumurtalık encapsulating OSE ile korunur. Şekil 2'de görüldüğü gibi, çeyrek veya sekizde oyulmuş yumurtalıklara karşılaştırıldığında yarıya yumurtalıkların OSE daha yumurtalık tamamen kapsülleyen. Over yara onarımıyüzey tüm yumurtalık bağlamında incelenebilir ve yumurtlama ve yüzey tamir over yüzey dönüşüm indükler nasıl ışık tutabilir.
Deneyin son nokta, gerekli bilgileri bağlıdır. Mimari dokusu, hücresel morfoloji ve spesifik hücresel büyüme oranları kesitler kullanılarak kolayca takip edilmektedir. Örneğin, 7 gün boyunca 5 mg / ml insülin Ayrıca over yüzey epiteli ve çok katmanlı oluşumu hiperproliferasyonu indükler, tek bir over yüzey epitel tabakası 7 gün (Şekil 3A), serum serbest αMEM kültür sonra görülmektedir hücreleri (Şekil 3B). Fiksasyonu için 10 mcM 24 saat önce son bir konsantrasyonda kültürlere bromodeoxyuridine ekleyerek, hücre çoğalması (inset 3A ve 3B) ölçülebilir. Bakımı, serum serbest αMEM kültürler için, granüloza hücrelerinin daha büyük bir oranda çoğalırlar ise OSE yaklaşık% 3-5, 24 saat etiketleme dönemi sırasında (İçerlek 3A) yayılması tabi. Kültür ortamı insülin eklenmesi, toplam OSE yaklaşık% 30 (İçerlek 3B) OSE prolifere yüzdesi artar. Yeşil floresan proteininin (GFP) immünofloresan cDNA transfeksiyon (Şekil 3C) standart mikroskobu ile aljinat jel ile görüntülendi. Aljinat organ kültürü over yüzey epitel ve birincil foliküller büyüme ve analiz için sağlarken, olgun, ikincil foliküller bu kültürün sistemi (Şekil 3B) hayatta kalmak için başarısız olduğunu belirtmek gerekir. Başka bir yerde 10 bir aljinat hidrojel matriks içinde vade bireysel köklerinin Kültür tarif edilmiştir.
Protein ya da RNA değişiklikler tüm organ veya özel hücre tiplerinden enzimatik bozulması (Şekil 4) kullanılarak analiz edilebilir. Bazı stromal hücreler izole olmasına rağmen (Şekil 4D) kollajenaz ile kültüre over organoids tedavisi, altta yatan stroma pelet tedavi sonrasında elde edilen hücre OSE zenginleşmesi için izin verirken (Şekil 4C) sağlam bırakır.
Şekil 1 yaralama sonra OSE yaymak için kullanılan Fare yumurtalık üç boyutlu kültür sistemi. A) Mikroskop altında, Bursa ve çevresindeki yağ yastığı çıkarıldı. B) Bozulmamış oviductal tüp yumurtalık (O) (T) ve yağ yastığı (F). C) Bursa ve yağ yastığıyla birlikte Yumurtalık kaldırıldı (solda) ve uncoiled yumurtalık (sağda). D) Yumurtalık veya oviductal organoids aljinat bir damlacık içine yerleştirildi. E) Aljinatta kaplı organoids CaCl 2 çözüm crosslinking bir jel formu için aljinat içine düştü. F) Aljinatta over organoid kapsüllü. G) Aljinatta oviductal organoid kapsüllü. H) Aljinatta kapsüllü organoids kültür ortamında inkübe edildi.
Şekil 2. Yüzey alanı sitokeratin 8 ile ölçülen over yüzey rejenere. Sekizde, çeyrek, yarım, BSA orta kültür ve sitokeratin 8 (CK8) antikoru ile immünohistokimyasal analizi ile ölçülen oyulmuş sonra OSE over organoids Encapsulation.
Şekil 3 Aljinatta kültür sistemi, geçiş ve büyüme faktörlerinin OSE içine cDNA transfeksiyon sağlar, ancak hızlı bir büyüme ve olgunlaşma köklerinin desteklemiyor . A) Yumurtalık organoid OSE işaretleri CK8 ifade analiz bazal ortamda 7 gün boyunca kültür. Ankastre, seri bölümü BrdU eklenmesi için boyandı. B) kültür ortamı insülin eklenmesi OSE hiperplazi neden olur. Ankastre, seri bölümü BrdU eklenmesi için boyandı. C) Yumurtalık organoid GFP ifade cDNA ile transfekte. D) Aljinatta kültür sistemi primordial foliküllerin (kırmızı ok ucu) büyümesini destekler, ama olgun değil ikincil foliküller (siyah ok).
Şekil 4 OSE analizi aşağıdaki kültürü için izole edilebilir. A) 2 haftaya kadar orta ve kültüre organoid. B) Encapsulated organoid organoid sağlam çıkmak için aljinat liaz ile tedavi edilir. Yumurtalık işareti OSE CK8 ile boyandı. C) organoid yatan stroma ayrı OSE kollajenaz ile tedavi edilir. Kalan doku parçası over yüzey kaldırma vurgulamak için CK8 ile boyandı. D) CK8 (kırmızı) boyanmış olarak tedavi sonrası Toplanan hücrelerin OSE zenginleştirilmiştir. Hücreler, çekirdekleri işaretlemek için DAPI ile zıt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aljinat hidrojeller kullanan üç boyutlu organ kültürü sisteminin gelişimi organizmaların geniş bir yelpazede birçok farklı doku tipleri analiz etmek için çok yönlü bir yöntem temsil eder. 11 hücreleri büyümek için bir iskele sağlar 3D kültürlerin kullanımı, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanlarında uzatılabilir . Şu anda, bizim laboratuar insan yumurtalık ve fallop tüpü doku kullanarak ilk çalışmalar geçiyor, ancak, insan ve insan dışı primat folikülleri kültürü 12,13 tarif edilmiştir .
Hidrojeller diğer türleri üzerinde aljinat hidrojellerin kültür organoids kullanımı bu kollajen içeren, fibrin veya hyaluronik asit gibi birçok avantaj sunuyor. Jel organoid 14 kapsüller, oda sıcaklığı ve nötr pH Aljinatta jeller, doku çok az kesinti için . Aljinat doku büyümesini 5 kimyasal olarak inert bir destek sağlayarak, hücresel proteinler ile reaksiyona girmez . Jel kültür hücreleri 15 alımı için izin kapsüllü doku aşağılamak değildir enzimatik bozulmuş kullanarak aljinat liaz olabilir. Üç boyutlu doku kültürü için aljinat hidrojellerin kullanımının bir dezavantajı hidrojel için mekanik destek sağlayan iyonik crosslinking 5 fiksasyon önce sınırlı kültür dönemlere ve aljinat yeniden crosslinking gerektiren, zaman içinde istikrar kaybeder. Bu protokolün kritik boyutlarının yanı sıra, kültür süreci boyunca kısırlık yumurtalık ve oviductal doku doku morfolojisi aksaklıkları önlemek için dikkatli diseksiyon olarak sürdürmekteyiz.
SV40 T / t antijeni veya hTERT 16 ifade ölümsüzleştirdi sürece, örneğin, geleneksel hücre kültürü plastik kültüre over yüzey epitel hızla mezenkimal geçiş, morfolojik değişiklikleri ve hücre ölümüne epitel uğrar, çünkü yumurtalık ve yumurtalık, özellikle, bu yöntem için uygundur 17. Plastik normal OSE Zayıf bir büyüme potansiyel olarak pre-malign değişikliklerin analizi engellemektedir. Organ kültürü sistemi de over yüzey epitel ve oviductal epitel cells18 normal ve malign fizyolojisi bir rol oynayabilir yatan stromal hücreler ile temas halinde büyümesini destekler. Aljinat hidrojeller bu doku tiplerinin Kültür jel kendisi hücreleri 5 ile etkileşim yok iken, üç boyutlu mimari doku korumak için mekanik destek sağlar.
Kültür over yüzey epitel veya oviductal epitel için bu yöntemi kullanma kültürü izole manipülasyonlar sonucu moleküler ve morfolojik değişikliklerin analizi için sağlar. Aljinat hidrojel sistemi, ücretsiz transfekte cDNA, siRNA geçişi shRNA yanı sıra hormonlar, büyüme faktörleri 19 izin verir . Geçici transfeksiyon bu hücre tipi granüloza hücreleri gibi diğer yumurtalığın iç hücre tipleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek organoid transfeksiyon verimliliği dış yüzeyinde OSE içinde elde edildiği için, OSE için spesifik değildir. Deneysel koşullar yanıt hücresel büyüme izleme değişiklikler hücreler bölünerek kültür dönemi etiketler sırasında bromodeoxyuridine Incorporation. Sonra neoplastik değişikliklerin yol açan mekanizmaları aydınlatmak için RNA ve protein düzeyinde moleküler değişiklikler tespit edilebilir.
Yumurtalık kanseri kesin etyolojisi bilinmemekle beraber, ömür boyu ovulasyon artan bir sayıda, yumurtalık kanseri 20 için bir risk artışı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir . Yumurtalık kanseri yumurtlama bağlayan hipotezler in vivo analizi gonadotropinler, yayılması ve karsinogenez 21-23 inflamasyon katkıları belirlenmesinde pek çok zorluklarla karşı karşıya . Yumurtalıklar ve siyon hatası Aljinatta hidrojel kültür, yumurtalık kanseri ve normal hücreleri tümörlere ilerlemesi kökeni hakkında yeni bilgiler için önde gelen over yüzey epitel ve oviductal epitel izole, bu bileşenlerin her birinin doğrudan bir karşılaştırma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ifşa etmek için hiçbir şey yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Yumurtalık Kanseri Araştırma tarafından desteklenen Fonu [hibe LT/UIC/01.2011], Klinik ve Translasyonel Bilim, UIC Kanser Merkezi ve Sağlık hibe C06RR15482 National Institutes of UIC Merkezi.
UIC Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış hayvan bakım protokolleri altında AAALAC tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Bu proje için Animals of Illinois at Chicago Üniversitesi Biyolojik Kaynaklar Laboratuvarı (BRL) bariyer odalar yerleştirilmiştir. BRL, günde en az iki kez hayvanlar izler ve hayvan bakımı konusunda danışmanlık sağlayan bir tam veteriner bir kadroya sahiptir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as biomaterials. Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
