Summary
Cultuur van normale cellen in hun drie-dimensionale context is een alternatieve methode voor vroege gebeurtenissen die nodig is voor cellulaire transformatie en tumorvorming te bestuderen. Deze methode wordt gebruikt om de normale eierstokken en oviductal cellen groeien naar vroege gebeurtenissen bij eierstokkanker vorming te bestuderen.
Abstract
Eierstokkanker is de vijfde belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen en heeft een 63% sterfte in de Verenigde Staten 1. Het celtype van oorsprong voor eierstokkanker is nog steeds in vraag en kunnen zowel ovariële oppervlakte-epitheel (OSE) of het distale epitheel van de eileider fimbriae 2,3. Het kweken van de normale cellen als een primaire cultuur in vitro in staat zal stellen wetenschappers om specifieke wijzigingen die zouden kunnen leiden tot kanker van de eierstokken in de verschillende epitheel, waardoor definitief het celtype van herkomst bepalen model. Dit zal toelaten de ontwikkeling van meer accurate biomarkers, diermodellen met weefsel-specifieke genetische veranderingen, en de beste preventiestrategieën gericht op deze ziekte.
Behoud van normale cellen in alginaat hydrogelen bevordert de korte termijn in vitro cultuur van cellen in hun drie-dimensionale context en maakt de invoering van plasmide DNA, siRNA, en kleine moleculen. Door het kweken van organen in stukken die zijn afgeleid van de strategische snijdt met behulp van een scalpel, verschillende culturen uit een enkel orgaan kan worden gegenereerd, waardoor het aantal experimenten uit een enkel dier. Deze besparingen model aspecten van de ovulatie leidt tot verspreiding van het OSE, die wordt geassocieerd met eierstokkanker formatie. Celtypen, zoals de OSE die niet goed groeien op plastic oppervlakken kunnen worden gekweekt met behulp van deze methode en te vergemakkelijken onderzoek naar de normale cellulaire processen of de vroegste gebeurtenissen in de vorming van kanker 4.
Alginaat hydrogelen kan worden gebruikt om de groei van vele soorten weefsels 5 ondersteunen. Alginaat is een lineaire polysaccharide bestaat uit repeterende eenheden van β-D-mannuronic zuur en α-L-guluronzuur die kunnen worden verknoopt met calcium-ionen, resulterend in een zachte geleermiddelen actie die geen schade weefsels 6,7. Net als andere drie-dimensionale celcultuur matrices, zoals Matrigel, alginaat biedt mechanische ondersteuning voor weefsels, maar eiwitten zijn niet reactief met het alginaat matrix, en dus alginaat functioneert als een synthetisch extracellulaire matrix die niet starten cell signaling 5. Het alginaat hydrogel drijft in de standaard celcultuurmedium en ondersteunt de architectuur van het weefsel groei in vitro.
Een methode wordt voorgesteld voor de voorbereiding, scheiding, en inbedding van eierstok-en oviductal orgel stukken in alginaat hydrogels, die in cultuur worden gehouden voor maximaal twee weken. De enzymatische release van cellen voor de analyse van eiwitten en RNA monsters van de orgelcultuur wordt ook beschreven. Ten slotte is de groei van de primaire celtypen is mogelijk zonder genetische immortalisatie van muizen en vergunningen onderzoekers om knockout en transgene muizen te gebruiken.
Protocol
1. Ovarieel dissectie en weefsel isolatie
- Bereid een 0,5% (w / v) oplossing van natrium-alginaat, bereiden van een gewijzigde versie van het protocol eerder beschreven 5, met steriele PBS en warmte tot 37 ° C. Meng door inversie of schommelen, maar niet vortex. Teken het alginaat in een 1 ml spuit met een 25 G naald en te handhaven op 37 ° C.
- Bereid 10 mM steriele CaCl 2-oplossing voor het verknopen van de alginaat op weefsel inkapseling en warm tot 37 ° C.
- Voor te bereiden 1 ml kweekmedium (αMEM + 5 eenheden penicilline en 5 ug / ml streptomycine) per putje in een 24 wells plaat voor elk experiment. Onder andere verschillende drugs, peptiden, of virussen in het kweekmedium. Voor de transfectie voor orgel inkapseling, incubeer weefsel met Lipofectamine 2000 en plasmide DNA gedurende vier uur bij 37 ° C.
- Ontleden van de organen van het dier, verwijder het vet of residuele weefsel voorzichtig trek de slijmbeurs membraan rond de eierstokken, en snijd de eierstokken of eileider in vier stukken door halverend het orgel. Dieren werden gedood door de CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. Voor de eileider, voorzichtig Rol het weefsel door te trekken uit elkaar aansluiten van de membranen en de uitbreiding van de uiteinden van de buis in tegengestelde richtingen met behulp van een tang voor het snijden.
- Plaats een alginaat druppel (~ 1-3 pi) op een gesteriliseerde mesh vezel.
- Met behulp van steriele pincet, verplaatsen van een stuk van orgel in de alginaat druppel en het centrum van de druppel met behulp van een tang of een steriele naald.
- Omgekeerde de druppel die de orgelwerk (organoid) door het gaas vast te pakken vezel met een steriele pincet en draaien op zijn kop, zodat de zwaartekracht aan het alginaat dwingen in een opknoping druppel.
- Tik op de tang op de rand van een 10cm petrischaaltje met 10 mM CaCl 2-oplossing, zodat de daling valt in de oplossing.
- Incubeer gedurende 2 minuten, te verwijderen met steriele lepel met poriën voor extra 10 mM CaCl2, en breng introductie in het kweekmedium. Tot vier alginaat gels kunnen worden overgebracht in een putje van een 24 wells plaat met daarin het kweekmedium. Cultuur voor een bepaalde periode.
2. Afbraak van alginaat en het verzamelen van cellen
- Voor de oplosbaarheid van het alginaat gel, incubeer de culturen in alginaat lyase (3,4 mg / ml) opgelost in L-15 Leibovitz de media bij 37 ° C gedurende 30 minuten of tot de gel volledig is opgelost.
- Verwijder het weefsel van het alginaat lyase.
- Voor het verzamelen van de OSE, incubeer de organoid met 500 eenheden van collagenase in Leibovitz's L-15 media voor 1 uur 8. Vortex in 2 seconden pulsen (2 seconden vortex en 2 seconden rust), op middellange vermogen gedurende 1 minuut, gevolgd door een seconde pulsen (1 seconde vortex en een seconde rust) gedurende 1 minuut. Laat orgel stukken vallen naar onderkant van microcentrifugebuis en pipet supernatant naar vers steriel microcentrifugebuis. Centrifugeer 3 minuten bij 3000 rpm te pellet ovariële oppervlakte-epitheel.
- Voor het verzamelen van de eileiders epitheel, in de lengte snijden de buis en leg ze op weefselkweek plastic in DMEM met 5 eenheden penicilline en 5 ug / ml streptomycine en 4% (v / v) FBS. Gedurende 3-5 dagen, zal cellen "kruipen" uit de eileiders stroma en groeien op weefselkweek plastic9.
3. Fixatie van alginaat ingekapseld orgaan culturen paraffinecoupes
- Verzamel de alginaat ingekapseld kraal van het kweekmedium bij geselecteerde tijdstip.
- Recrosslink de alginaat om de gel te verstijven door het droppen van de cultuur in steriele 10 mM CaCl 2-oplossing voor de twee minuten.
- Bevestig de alginaat ingekapseld orgel in 2% paraformaldehyde die 50 mM sucrose, 10 mM CaCl 2 en 50 mM natrium-cacodylate om ervoor te zorgen dat de gel blijft solide en volledig inkapselt weefsel tijdens fixatie.
- Na verwerking van weefsel, embed het hele alginaat-ingekapselde orgelcultuur stuk in paraffine en sectie met een microtoom tot 5 urn secties te genereren.
- Het alginaat zal worden ontbonden en uit het dia als het uitvoeren van immunohistochemie te wijten aan op basis van antigen retrieval warmte. Het alginaat zal blijven en vlekken voor eosine onder staande hematoxyline en eosine kleuring.
4. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van een drie-dimensionale orgelcultuur van de eierstokken en de eileider is weergegeven in figuur 1. Eierstokken kunnen worden gesneden in verschillende grootte stukken, en OSE vermenigvuldigen en migreren naar de oppervlakte die werd gewond uit de incisie met de scalpel te repareren. Tijdens dit proces, is de juiste oriëntatie van de OSE ten opzichte van de onderliggende stroma gehandhaafd, met een OSE het inkapselen van de eierstok. Zoals weergegeven in figuur 2, de OSE van de eierstokken gehalveerd kapselen de eierstok meer volledig in vergelijking met de eierstokken snijd ze in kwarten of achtsten. De wond herstel van de ovariëleoppervlak kan worden bestudeerd in de context van de gehele eierstok en licht kunnen werpen op hoe de ovulatie en het oppervlak repareren induceert ovariële oppervlak transformatie.
Het eindpunt van het experiment is afhankelijk van de informatie die nodig is. Tissue architectuur, cellulaire morfologie, en specifieke cellulaire groei tarieven zijn eenvoudig gecontroleerd met behulp van paraffine secties. Bijvoorbeeld, is een enkele laag van de ovariële oppervlakte-epitheel waargenomen na kweken in serum-vrij αMEM voor 7 dagen (Figuur 3A), terwijl de toevoeging van 5 ug / ml insuline voor 7 dagen induceert hyperproliferatie van de ovariële oppervlakte-epitheel en de vorming van meerdere lagen cellen (Figuur 3B). Door het toevoegen van broomdeoxyuridine om de culturen in een uiteindelijke concentratie van 10 uM 24 uur voorafgaand aan de fixatie, kan de proliferatie van cellen worden gemeten (inzet 3A en 3B). Voor de culturen onderhouden in serum-vrij αMEM, ongeveer 3-5% van OSE ondergaan proliferatie tijdens de 24 uur etikettering periode (inzet 3A), terwijl een groter percentage van granulosacellen vermenigvuldigen. Toevoeging van insuline aan de cultuur media verhoogt het percentage van de prolifererende OSE tot ongeveer 30% van het totale OSE (inzet 3B). Immunofluorescentie van groen fluorescerend eiwit (GFP) kan gevisualiseerd door het alginaat gel met standaard microscopie worden na transfectie cDNA (figuur 3C). Terwijl alginaat orgelcultuur zorgt voor de groei en de analyse van ovariële oppervlakte-epitheel en primaire follikels, dient te worden opgemerkt dat de rijpe, secundaire follikels niet om te overleven in deze cultuur systeem (Figuur 3D). Cultuur van de individuele follikels tot de vervaldatum in een alginaat hydrogel matrix is elders 10 beschreven.
Veranderingen in de eiwit-of RNA kan worden geanalyseerd vanuit het gehele orgaan of van specifieke celtypen met behulp van enzymatische afbraak (figuur 4). Behandeling van gekweekte ovariële organoids met collagenase laat de onderliggende stroma intact (figuur 4C) terwijl voor de verrijking van OSE in de cel pellet verkregen na de behandeling, hoewel sommige stromale cellen zijn ook geïsoleerd (Figuur 4D).
Figuur 1. Mouse eierstok drie-dimensionale cultuur-systeem gebruikt om de OSE uitbreiden na verwonding. A) Onder de microscoop zijn de slijmbeurs en de omliggende vet pad verwijderd. B) Intact ovarium (O) met oviductal buis (T) en vet pad (F). C) ovariumcellen met bursa en vet pad verwijderd (links) en ontrolde eileider (rechts). D) ovarium-of oviductal organoids werden geplaatst in een alginaat druppel. E) Alginaat gevat organoids werden gedropt in een CaCl 2-oplossing verknoping van de alginaat om een gel te vormen. F) Alginaat ingekapseld ovarium organoid. G) Alginaat ingekapseld oviductal organoid. H) Alginaat ingekapseld organoids geïncubeerd in kweekmedium.
Figuur 2. Oppervlakte geregenereerd door de eierstokken het oppervlak gemeten door cytokeratine 8. Inkapseling van ovariële organoids door de OSE nadat ze gesneden in achtsten, kwartalen en helften, gekweekt in BSA medium, en gemeten door immunohistochemische analyse met behulp van cytokeratine 8 (CK8) antilichaam.
Figuur 3. Alginaat cultuur systeem maakt het mogelijk doorgang van groeifactoren en transfectie van cDNA in de OSE, maar biedt geen ondersteuning snelle groei en de rijping van follikels. A) Ovarian organoid gekweekt voor 7 dagen in de basale medium geanalyseerd op CK8 expressie, die de OSE merken. Inzet, seriële sectie gekleurd voor BrdU incorporatie. B) Toevoeging van insuline aan het kweekmedium induceert hyperplasie van de OSE. Inzet, seriële sectie gekleurd voor BrdU incorporatie. C) Ovarian organoid getransfecteerd met cDNA om GFP te drukken. D) Alginaat cultuur systeem ondersteunt de groei van primordiale follikels (rode pijlpunt), maar niet volwassen secundaire follikels (zwarte pijl).
Figuur 4. OSE kan geïsoleerd worden voor analyse na cultuur. A) Organoid gekweekt in medium voor maximaal 2 weken. B) Ingekapselde organoid wordt behandeld met alginaat lyase om te vertrekken organoid intact. Eierstok is gekleurd met CK8 te markeren OSE. C) Organoid wordt behandeld met collagenase te scheiden OSE uit de onderliggende stroma. Restmateriaal stuk werd gekleurd met CK8 om de verwijdering van de ovariële oppervlak te markeren. D) zijn verzameld cellen na een behandeling zijn verrijkt voor OSE-als gekleurd voor CK8 (rood). Cellen worden tegengekleurd met DAPI om kernen te markeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van een driedimensionaal orgelcultuur systeem gebruik te maken van alginaat hydrogelen is een veelzijdige methode voor het analyseren van verschillende soorten weefsel uit een grote verscheidenheid van organismen. Het gebruik van 3D culturen kan worden uitgebreid tot het gebied van tissue engineering en regeneratieve geneeskunde omdat het een steiger waarop cellen kunnen groeien 11. Momenteel is ons laboratorium die een initiële onderzoek met humane ovarium en eileiders weefsel, maar de cultuur van de menselijke en niet-menselijke primaat follikels is beschreven 12,13.
Het gebruik van alginaat hydrogels voor cultuur organoids biedt diverse voordelen ten opzichte van andere vormen van hydrogels, zoals die waarin collageen, fibrine, of hyaluronzuur. Alginaat gels bij kamertemperatuur en neutrale pH, waardoor voor kleine verstoring van het weefsel als de gel kapselt de organoid 14. Alginaat reageert niet met cellulaire eiwitten, die een chemisch inert ondersteuning voor weefselgroei 5. De gel kan enzymatisch afgebroken met behulp van alginaat lyase, wat niet ten koste van de ingekapselde weefsel, waardoor voor het terugzoeken van gekweekte cellen 15. Een nadeel van het gebruik van alginaat hydrogels voor drie-dimensionele tissue cultuur is dat de ionische verknoping bieden mechanische ondersteuning voor de hydrogel stabiliteit verliest na verloop van tijd, cultuur noodzakelijk beperkte periode en opnieuw verknoping van de alginaat voorafgaand aan de fixatie 5. Kritische aspecten van dit protocol zijn behoud van de steriliteit gedurende de cultuur proces, evenals een zorgvuldige ontleding van de ovariële en oviductal weefsel om verstoringen te voorkomen dat het weefsel morfologie.
De eierstok en eileider zijn bijzonder geschikt voor deze methode omdat de eierstokken oppervlakte-epitheel gekweekt op de traditionele celcultuur plastic snel ondergaat epitheliale naar mesenchymale transitie, morfologische veranderingen, en celdood, tenzij vereeuwigd, bijvoorbeeld door expressie van SV40 T / t-antigeen of hTERT 16, 17. Slechte groei van normale OSE op plastic belemmert analyse van potentieel premaligne veranderingen. De orgelcultuur systeem ondersteunt ook de groei van de ovariële oppervlakte-epitheel of oviductal epitheel in contact met de onderliggende stromale cellen, die een rol kunnen spelen in de normale en maligne fysiologie van het cells18. Cultuur van deze weefseltypen in alginaat hydrogelen biedt mechanische ondersteuning aan de driedimensionale architectuur van het weefsel te behouden, terwijl de gel zelf geen interactie met de cellen 5.
Met behulp van deze methode voor het kweken van ovariële oppervlakte-epitheel of oviductal epitheel maakt voor de analyse van moleculaire en morfologische veranderingen ten gevolge van geïsoleerde manipulaties van de cultuur. Het alginaat hydrogel-systeem maakt een vrije doorgang van de getransfecteerde cDNA, siRNA, en shRNA, maar ook hormonen, en groeifactoren 19. Terwijl de transiënte transfectie is niet specifiek voor de OSE, omdat dit type cel is aan de buitenkant van de organoid hogere transfectie-efficiëntie is bereikt in de OSE in vergelijking met andere soorten cellen in het binnenste van de eierstokken, zoals granulosacellen. Integratie van broomdeoxyuridine gedurende de cultuur periode labels delende cellen door het bewaken van veranderingen in de cellulaire groei in reactie op de experimentele omstandigheden. Moleculaire veranderingen bij de RNA of eiwit niveau kan dan worden bepaald om mechanismen die leiden tot neoplastische veranderingen toe te lichten.
Hoewel de precieze oorzaak van eierstokkanker is niet bekend, hebben een toename van het aantal van de levensduur van ovulaties blijkt te correleren met een verhoogd risico op eierstokkanker 20. In vivo analyse van de hypothesen het koppelen van de ovulatie te eierstokkanker biedt vele uitdagingen in het bepalen van de bijdragen van de gonadotrofinen, proliferatie en ontsteking te carcinogenese 21-23. Alginaat hydrogel cultuur van eierstokken en eileiders kunnen voor geïsoleerde, directe vergelijking van elk van deze componenten in de ovariële oppervlakte epitheel en oviductal epitheel, wat leidt tot nieuwe informatie over het ontstaan van kanker van de eierstokken en de progressie van normale cellen tot tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Ovarian Cancer Research Fund [subsidie LT/UIC/01.2011], de UIC Centrum voor klinisch en translationeel Science, de UIC Cancer Center, en de National Institutes of Health te verlenen C06RR15482.
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door AAALAC ingesteld op grond van goedgekeurde dieren zorgprotocollen door de Animal Care en gebruik Comite op UIC. Dieren voor dit project zijn ondergebracht op het vlak van kamers in de biologische rijkdommen Laboratory (BRL) aan de Universiteit van Illinois in Chicago. De BRL heeft een volledig diergeneeskundig personeel dat dieren controleert minstens tweemaal per dag en geeft advies over de verzorging van dieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as biomaterials. Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
