Summary
Kultur av normala celler i sina tredimensionella sammanhang representerar en alternativ metod för att studera tidiga händelser som krävs för cellulär omvandling och Tumörgenesens. Denna metod används för att odla normala äggstockar och oviductal celler för att studera tidiga händelser i äggstockscancer formation.
Abstract
Äggstockscancer är den femte vanligaste orsaken till dödsfall i cancer hos kvinnor och har en 63% dödlighet i USA 1. Den celltyp ursprungsbeteckningar för äggstockscancer är fortfarande aktuella och kan vara antingen äggstockscancer ytan epitelet (OSE) eller distala epitelet i äggledaren fimbriae 2,3. Odling av normala celler som primär kultur in vitro kommer att möjliggöra för forskare att modell specifika förändringar som kan leda till äggstockscancer i olika epitel, vilket definitivt avgöra cellen typ av ursprung. Detta kommer att möjliggöra utveckling av mer exakta biomarkörer, djurmodeller med vävnad-specifika genen förändras, och bättre förebyggande strategier riktade mot denna sjukdom.
Att upprätthålla normala celler i alginat hydrogel främjar kortsiktiga in vitro-kultur av celler i sina tredimensionella sammanhang och möjliggör införandet av plasmid-DNA, siRNA och små molekyler. Genom att odla organ i bitar som kommer från strategiska snitt med skalpell, flera kulturer från ett enda organ kan genereras, vilket ökar antalet försök från ett enda djur. Dessa nedskärningar modell aspekter av ägglossningen som leder till spridning av OSE, som förknippas med äggstockscancer bildas. Celltyper som OSE, som inte växer bra på plast ytor kan odlas med denna metod och underlätta utredning av normala cellulära processer eller de tidigaste händelserna i cancer bildas 4.
Alginat hydrogeler kan användas för att stödja tillväxten av många typer av vävnader 5. Alginat är en linjär polysackarid som består av upprepade enheter β-D-mannuronic syra och α-L-guluronic syra som kan tvärbunden med kalciumjoner, vilket resulterar i en mild gelbildande handling som inte skadar vävnaderna 6,7. Liksom andra tredimensionella matriser cellodling som Matrigel ger alginat mekaniskt stöd för vävnader, men proteiner är inte reaktivt med alginat matris, och fungerar därför alginat som en syntetisk extracellulär matris som inte initiera cellsignalering 5. Den alginat hydrogel flyter i standard cellodlingsmedium och stödjer arkitekturen i vävnad tillväxt in vitro.
En metod presenteras för beredning, separation, och inbäddning av äggstockscancer och oviductal organdelar i alginat hydrogeler, som kan hållas i kultur i upp till två veckor. Den enzymatiska versionen av celler för analys av proteiner och RNA prover från orgeln kulturen beskrivs också. Slutligen är tillväxten av primära celltyper möjligt utan genetiska immortalisering från möss och tillstånd utredarna att använda knockout och transgena möss.
Protocol
1. Ovarian dissektion och vävnad isolering
- Bered en 0,5% (w / v) lösning av natriumalginat, förbereda ur en modifierad version av det protokoll som tidigare beskrivits 5, med hjälp av sterila PBS och värme till 37 ° C. Blanda genom inversion eller vagga, men inte virvel. Rita alginat i en 1 ml spruta med en 25 G-nål och bibehålla vid 37 ° C.
- Förbered 10 mM steril CaCl 2 lösning för broarna alginat på vävnaden inkapsling och värm till 37 ° C.
- Förbered 1 mL odlingsmedium (αMEM + 5 enheter penicillin och 5 mikrogram / ml streptomycin) per brunn i en 24 brunnar för varje experiment. Inkludera olika läkemedel, peptider eller virus i odlingsmedium. För transfektion före orgel inkapsling, inkubera vävnaden med Lipofectamine 2000 och plasmid-DNA i fyra timmar vid 37 ° C.
- Dissekera organ från djuret, ta bort fett eller rester av vävnad, dra försiktigt bort bursa membran som omger äggstock, och skär äggstock eller äggledare i fyra bitar genom Halvera orgeln. Djur avlivas av CO 2 kvävning följt av halsdislokation. För äggledare försiktigt Rulla ut vävnaden genom att dra isär den anslutande membran och förlängning ändarna av röret i motsatt riktning med hjälp av pincetten före kapning.
- Placera en alginat droppe (~ 1-3 mikroliter) på en steriliserad nät fiber.
- Använda steril tång, flytta en bit av organ i alginat droppe och centrera droppen Använd pincett eller en steril nål.
- Vänd droppen som innehåller orgel pjäs (organoid) genom att greppa mesh fiber med steril pincett och vända den upp och ner för att låta gravitationen att tvinga alginat i en hängande droppe.
- Tryck på pincetten på kanten av en 10 cm petriskål med 10 mM CaCl 2-lösning så att den droppe faller i lösning.
- Inkubera i 2 minuter, ta med sterilt sked innehåller porer för att frigöra ytterligare 10 mM CaCl 2, och överför till odlingsmediet. Upp till fyra alginat geler kan överföras till en enda väl av en 24 brunnar innehållande odlingsmedium. Kultur för en definierad tidsperiod.
2. Nedbrytning av alginat och insamling av celler
- För lösningsgörande av alginat gel, inkubera kulturer i alginat lyase (3,4 mg / ml) löses i Leibovitz är L-15 medier vid 37 ° C i 30 minuter eller tills gelen är helt upplöst.
- Ta bort vävnad från alginat lyase.
- För insamling av OSE, inkubera organoid med 500 enheter av kollagenas i Leibovitz är L-15 media för 1 timme 8. Vortex i 2 sekunder pulser (2 sekunder virvel och 2 sekunder vila) på medelhög effekt i 1 minut, följt av 1 sekund pulser (1 sekund Vortex och 1 sekund vila) i 1 minut. Låt orgel bitar faller till botten av mikrocentrifugrör och pipettera supernatanten i färsk sterilt mikrocentrifugrör. Centrifugera 3 minuter vid 3000 rpm till pellets äggstockarna ytan epitel.
- För insamling av äggledarna epitel, skär röret på längden och lägg på vävnadsodling plast i DMEM med 5 enheter penicillin och 5 mikrogram / ml streptomycin och 4% (v / v) FBS. Över 3-5 dagar, kommer celler "krypa" ur Tubal stroma och växa på vävnadsodling plastic9.
3. Fixering av alginat inkapslade orgel kulturer för paraffin
- Samla alginat inkapslade pärla från odlingsmediet på utvalda tidpunkt.
- Recrosslink den alginat att stelna gelen genom att släppa den kultur i sterila 10 mM CaCl 2-lösning i två minuter.
- Fäst alginat inkapslade orgeln i 2% paraformaldehyd innehållande 50 mM sackaros, 10 mm CaCl 2 och 50 mm natrium cacodylate att se till att gelen hålls fast och fullt kapslar vävnad under fixering.
- Efter vävnad bearbetning, bädda in hela alginat-inkapslade bit orgel kultur i paraffin och avsnitt med en mikrotom att generera 5 ìm sektioner.
- Den alginat kommer att upplösas och tas bort från bilden om du utför immunohistokemi på grund av värme baserat antigenåtervinning. Den alginat förblir och bets för eosin i stående hematoxylin och eosin färgning.
4. Representativa resultat:
Ett exempel på en tredimensionell organ kultur i äggstockarna och äggledare visas i figur 1. Äggstockarna kan skäras i olika storlek bitar, och OSE föröka sig och migrera till reparera yta som sårades i snitt med skalpell. Under denna process är rätt orientering av OSE i förhållande till det underliggande stromat upprätthållas, med OSE kapsla äggstocken. Som framgår av Figur 2, OSE i äggstockarna halvera kapsla äggstockarna mer fullständigt jämfört med äggstockar skurna i fjärdedelar eller åttondelar. Såret reparation av äggstockarnaYtan kan studeras inom ramen för hela äggstocken och kan belysa hur ägglossningen och yta reparera inducerar omvandling äggstockarna yta.
Slutpunkten av experimentet beror på den information som krävs. Tissue arkitektur, cellulär morfologi, och specifika cellulära tillväxttakten är lätt kontrolleras med hjälp av paraffin. Till exempel är ett enda lager av äggstockarna yta epitel observerats efter odling i serum-fri αMEM i 7 dagar (Figur 3A), medan tillsats av 5 mikrogram / ml insulin för 7 dagar inducerar hyperproliferation av äggstockarna ytan epitel och bildandet av flera celler (Figur 3B). Genom att lägga bromodeoxyuridine till kulturer i en slutlig koncentration av 10 mikroM 24 tim före fixering, kan spridning av celler mätas (infälld 3A och 3B). För kulturerna bibehålls i serum-fri αMEM, cirka 3-5% av OSE genomgår spridning under 24 tim märkning perioden (infälld 3A), medan en större andel av granulosa celler föröka sig. Tillägg av insulin till kulturen medier ökar andelen förökar OSE till ca 30% av det totala OSE (infälld 3B). Immunofluorescens av grönt fluorescerande protein (GFP) kan visualiseras genom alginat gel med standard mikroskopi efter cDNA transfektion (figur 3C). Medan alginat orgel kultur ger för tillväxt och analys av äggstockarnas yta epitel och primära folliklar, bör det noteras att mogna, sekundära folliklar misslyckas med att överleva i denna kultur-systemet (Figur 3D). Kultur av enskilda folliklar till förfall inom ett alginat hydrogel matris har beskrivits på andra ställen 10.
Förändringar i protein eller RNA kan analyseras från hela organet eller från specifika celltyper med hjälp av enzymatisk nedbrytning (Figur 4). Behandling av odlade äggstockarna organoids med kollagenas lämnar underliggande stroma intakt (Figur 4C) samtidigt för anrikning av OSE i cellpelleten erhållits efter behandling, även om vissa stromaceller är också isolerade (Figur 4D).
Figur 1. Mouse ovary tredimensionell kultur som används för att sprida OSE efter skadade. A) i mikroskop var bursa och det omgivande fettet pad bort. B) Intakt äggstockar (O) med oviductal röret (T) och fett pad (F). C) Äggstock med Bursa och fett pad bort (vänster) och hoprullad äggledare (höger). D) äggstocks-eller oviductal organoids placerades in i en alginat droppe. E) Alginat inneslutet organoids släpptes in i en CaCl 2 lösning broarna alginat för att bilda en gel. F) Alginat inkapslade äggstockscancer organoid. G) Alginat inkapslade oviductal organoid. H) Alginat inkapslade organoids inkuberas i odlingsmedium.
Figur 2. Yta regenereras genom äggstockarna yta mäts med Cytokeratin 8. Inkapsling av äggstockarna organoids av OSE efter att ha blivit skuren i åttondelar, fjärdedelar, och halvor, odlade i BSA medium och mätas med immunhistokemisk analys med Cytokeratin 8 (CK8) antikroppar.
Figur 3. Alginat kultur systemet tillåter passage av tillväxtfaktorer och transfektion av cDNA i OSE, men stöder inte en snabb tillväxt och mognad av folliklar. A) på äggstockarna organoid odlade under 7 dagar i bassubstratets analyseras för CK8 uttryck, som markerar OSE. Inset, seriell avsnitt färgas för BrdU inbyggnad. B) tillägg av insulin till odlingsmedia inducerar hyperplasi av OSE. Inset, seriell avsnitt färgas för BrdU inbyggnad. C) på äggstockarna organoid transfekterade med cDNA att uttrycka GFP. D) Alginat kultur Systemet stöder tillväxten av primordial folliklar (röd pil), men inte mogna sekundära folliklar (svart pil).
Figur 4. OSE kan isoleras för analys efter kultur. A) Organoid odlas i medium för upp till 2 veckor. B) Encapsulated organoid behandlas med alginat lyase att lämna organoid intakt. Äggstocken färgas med CK8 att markera OSE. C) Organoid behandlas med kollagenas att separera OSE från underliggande stroma. Resterande vävnad Verket färgas med CK8 att belysa avlägsnande av äggstockarna ytan. D) Insamlade celler efter behandling anrikas för OSE som färgas för CK8 (röd). Celler är counterstained med DAPI att markera kärnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av en tredimensionell organsystem kultur-systemet utnyttjar alginat hydrogel är en mångsidig metod för att analysera många olika typer av vävnad från en mängd olika organismer. Användandet av 3D-kulturer kan utökas till områdena tissue engineering och regenerativ medicin, eftersom det ger en klätterställning som celler kan växa 11. För närvarande är vårt laboratorium som genomgår grundläggande studier med humana äggstockar och äggledare vävnad, men har kultur av mänskliga och icke-mänskliga primater folliklar har beskrivits 12,13.
Användningen av alginat hydrogeler till kultur organoids erbjuder flera fördelar jämfört med andra typer av hydrogeler, som de innehåller kollagen, fibrin eller hyaluronsyra. Alginat geler i rumstemperatur och neutralt pH-värde, som ger för lite störning i vävnaden som gel kapslar in organoid 14. Alginat reagerar inte med cellulära proteiner, som ger en kemiskt inert stöd för vävnad tillväxt 5. Gelen kan enzymatiskt bryts ned med hjälp av alginat lyase, som inte försämrar inkapslade vävnad, vilket möjliggör hämtning av odlade celler 15. En nackdel med att använda alginat hydrogeler för tredimensionell vävnad kultur är att den joniska crosslinking ger mekaniskt stöd för hydrogelen förlorar stabilitet över tiden, vilket nödvändiggör begränsad kultur perioder och åter crosslinking av alginat före fixering 5. Kritiska aspekter av detta protokoll bibehålla sterilitet i hela kulturen processen, liksom noggrann dissekering av äggstockscancer och oviductal vävnad för att förhindra störningar i vävnaden morfologi.
Äggstockarna och äggledare är särskilt lämpade för denna metod eftersom äggstockarna yta epitel odlade på traditionell cellkultur plast snabbt genomgår epitelceller till mesenkymala övergång, morfologiska förändringar och celldöd förevigat om, till exempel genom uttryck av SV40 T / T-antigen eller hTERT 16, 17. Dålig tillväxt av normala OSE på plast hindrar analys av potentiellt premaligna förändringar. Orgeln kultur Systemet stöder också tillväxten av äggstockarna ytan epitel eller oviductal epitel i kontakt med den underliggande stromaceller, vilket kan spela en roll i det normala och maligna fysiologi cells18. Kultur för dessa typer av vävnad i alginat hydrogel ger mekaniskt stöd för att bibehålla den tredimensionella strukturen av vävnad, medan själva gelen inte interagerar med celler 5.
Med denna metod för odling äggstockscancer yta epitel eller oviductal epitel möjliggör analys av molekylära och morfologiska förändringar till följd av isolerade manipulationer av kulturen. Den alginat hydrogel Systemet tillåter fri passage för transfekterade cDNA, siRNA och shRNA samt hormoner och tillväxtfaktorer 19. Även övergående transfektion är inte specifikt för OSE, eftersom denna celltyp är på utsidan av organoid högre transfektion effektivitet uppnås i OSE jämfört med andra typer av celler i det inre av äggstockarna, såsom granulosa celler. Införlivande av bromodeoxyuridine under etiketterna kultur perioden delande celler genom att övervaka förändringar i celltillväxt som svar på experimentella förhållanden. Molekylära förändringar på RNA eller protein nivå kan sedan bestämmas att klarlägga mekanismer som leder till neoplastiska förändringar.
Medan den exakta etiologin av äggstockscancer är okänd, har ett ökat antal livstid ägglossning visats korrelera med en ökad risk för äggstockscancer 20. In vivo-analys av hypoteser länka ägglossning för äggstockscancer innebär många utmaningar för att fastställa bidragen från gonadotropiner, spridning, och inflammation till cancer 21-23. Alginat hydrogel kultur av äggstockarna och äggledarna möjliggör isolerade, direkt jämförelse mellan alla dessa komponenter i äggstockarna ytan epitel och oviductal epitel, vilket leder till ny information om ursprunget av äggstockscancer och dess progression från normala celler till tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av äggstockscancer stålforskningsfonden [bidrag LT/UIC/01.2011], UIC Centrum för klinisk och translationell forskning, UIC Cancer Center och National Institutes of Health bidrag C06RR15482.
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive AAALAC enligt godkända protokoll djurvård av Animal skötsel och användning kommittén vid UIC. Djur för detta projekt är inrymt i barriär rum i biologiska resurser Laboratory (BRL) vid University of Illinois i Chicago. BRL har en fullt veterinära personalen som övervakar djuren minst två gånger dagligen och ger råd om djurvård.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A.
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J.
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C.
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
