Summary
Culture de cellules normales dans leurs trois dimensions contexte représente une méthode alternative pour étudier les événements précoces nécessaires pour la transformation cellulaire et la tumorigenèse. Cette méthode est utilisée pour cultiver des cellules ovariennes normales et l'oviducte pour étudier les événements précoces de la formation de cancer de l'ovaire.
Abstract
Cancer de l'ovaire est la cinquième cause de décès par cancer chez la femme et a un taux de mortalité de 63% dans l'une aux États-Unis. Le type de cellules d'origine pour les cancers de l'ovaire est toujours en question et pourrait être soit l'épithélium de surface de l'ovaire (OSE) ou l'épithélium distale de la trompe de Fallope fimbriae 2,3. La culture des cellules normales comme une culture primaire in vitro, permettra aux scientifiques de modéliser les changements spécifiques qui pourraient conduire au cancer de l'ovaire dans l'épithélium distincts, ainsi définitivement la détermination du type de cellules d'origine. Ceci permettra le développement de biomarqueurs plus précises, des modèles animaux avec des changements tissu-spécifique des gènes, et les stratégies de prévention mieux ciblées à cette maladie.
Le maintien des cellules normales dans les hydrogels d'alginate favorise à court terme dans la culture in vitro de cellules dans leurs trois dimensions contexte et permet l'introduction d'ADN plasmidique, siARN, et des petites molécules. Par des organes en culture dans des pièces qui proviennent de coupures stratégiques à l'aide d'un scalpel, plusieurs cultures à partir d'un seul organe peut être généré, en augmentant le nombre d'expériences à partir d'un seul animal. Ces réductions des aspects du modèle de l'ovulation entraînant la prolifération de l'OSE, qui est associée à la formation du cancer de l'ovaire. Les types cellulaires tels que l'OSE qui ne poussent pas bien sur les surfaces en plastique peuvent être cultivés en utilisant cette méthode et faciliter les enquêtes dans les processus cellulaires normaux ou les premiers événements dans la formation du cancer 4.
Hydrogels d'alginate peut être utilisé pour soutenir la croissance de nombreux types de tissus 5. Alginate est un polysaccharide linéaire composé d'unités répétitives de β-D-mannuronique acide et α-L-guluronique acides qui peuvent être réticulés avec des ions calcium, résultant en une action gélifiante douce qui n'a pas les tissus des dommages 6,7. Comme d'autres matrices tridimensionnelles telles que la culture de cellules de Matrigel, alginate fournit un support mécanique pour les tissus, mais les protéines ne réagissent pas avec la matrice d'alginate, et donc les fonctions d'alginate comme une matrice extracellulaire qui synthétiques ne lance pas la signalisation cellulaire 5. L'hydrogel d'alginate flotte dans milieu de culture cellulaire standard et prend en charge l'architecture de la croissance des tissus in vitro.
Une méthode est présentée pour la préparation, la séparation, et l'incorporation de l'ovaire et de pièces d'orgue dans l'oviducte hydrogels d'alginate, qui peuvent être maintenues en culture pendant jusqu'à deux semaines. La libération enzymatique des cellules pour l'analyse des protéines et des échantillons d'ARN à partir de la culture d'organe est également décrite. Enfin, la croissance des types de cellules primaires n'est possible sans l'immortalisation génétique de souris et permet aux enquêteurs d'utiliser et de souris transgéniques knockout.
Protocol
1. La dissection des ovaires et de l'isolement des tissus
- Préparer une solution à 0,5% (p / v) d'alginate de sodium, de préparer à partir d'une version modifiée du protocole décrit précédemment 5, en utilisant PBS stérile et la chaleur à 37 ° C. Mélanger par inversion ou basculant, mais ne vortex. Dessinez l'alginate dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 25 G et de maintenir à 37 ° C.
- Préparer 10mM stérile solution de CaCl 2 pour la réticulation de l'alginate sur l'encapsulation de tissu et chaud à 37 ° C.
- Préparer 1 mL de milieu de culture (+ 5 unités aMEM pénicilline et 5 ug / ml de streptomycine) par puits dans une plaque à 24 puits pour chaque expérience. Inclure diverses drogues, les peptides, ou de virus dans le milieu de culture. Pour la transfection avant encapsulation d'organes, de tissus avec incuber Lipofectamine 2000 et l'ADN plasmidique pendant quatre heures à 37 ° C.
- Disséquer les organes de l'animal, enlever tout le tissu adipeux ou résiduelles, retirez doucement la membrane entourant l'ovaire Bursa, et couper l'ovaire ou l'oviducte en quatre morceaux par la bissectrice de l'orgue. Les animaux ont été euthanasiés par asphyxie CO 2 suivie par dislocation cervicale. Pour l'oviducte, doucement dérouler le tissu en tirant en dehors des membranes de raccordement et étendant les extrémités du tube dans des directions opposées l'aide de pinces avant de couper.
- Placez une goutte d'alginate unique (uL ~ 1-3) sur une fibre mailles stérilisé.
- En utilisant une pince stérile, déplacer une pièce d'orgue dans la goutte d'alginate et le centre de la goutte à l'aide de forceps ou d'une aiguille stérile.
- Inverser la gouttelette contenant la pièce pour orgue (organoïde) en saisissant la fibre filet avec des pinces stériles et en le tournant à l'envers pour permettre à la gravité de forcer l'alginate dans une goutte suspendue.
- Appuyez sur le pince sur le bord d'un plat de 10cm de Pétri contenant 10 mM de CaCl2 solution afin que la goutte tombe dans la solution.
- Incuber pendant 2 minutes, retirer avec une cuillère stérile contenant de libérer les pores supplémentaires 10mM CaCl 2, et le transfert dans le milieu de culture. Jusqu'à quatre gels d'alginate peut être transféré dans un seul puits d'une plaque de 24 puits contenant le milieu de culture. Culture pour une période de temps définie.
2. La dégradation de l'alginate et la collecte de cellules
- Pour la solubilisation du gel d'alginate, incuber les cultures dans l'alginate lyase (3,4 mg / ml) dissous dans Leibovitz L-15 des médias à 37 ° C pendant 30 minutes ou jusqu'à ce gel est complètement dissous.
- Retirez le tissu de la lyase d'alginate.
- Pour la collecte de l'OSE, incuber les organoïde avec 500 unités de collagénase dans Leibovitz L-15 des médias pendant 1 heure 8. Vortex à 2 impulsions seconde (2 secondes et 2 secondes de vortex reste) à puissance moyenne pendant 1 minute, suivie par une seconde impulsions (1 vortex secondes et 1 secondes de repos) pendant 1 minute. Laissez tomber des pièces d'orgue au fond du microtube et le surnageant de pipette dans le tube à centrifuger stérile frais. Centrifuger 3 minutes à 3000 rpm à l'épithélium de surface de l'ovaire granulés.
- Pour la collecte de l'épithélium des trompes, couper le tube de la longueur et les placer sur la culture de tissus en plastique dans du DMEM avec 5 unités de pénicilline et de 5 ug / ml de streptomycine et de 4% (v / v) de FBS. Plus de 3-5 jours, les cellules «ramper» hors du stroma des trompes et poussent sur plastic9 culture de tissus.
3. Fixation des cultures d'alginate organes encapsulés pour des sections de paraffine
- Recueillir l'alginate encapsulé perle du milieu de culture au point de temps sélectionné.
- Recrosslink l'alginate de rigidifier le gel en laissant tomber la culture dans 10 mM stérile solution de CaCl 2 pendant deux minutes.
- Fixer l'organe d'alginate encapsulé dans du paraformaldéhyde à 2% contenant 50 mM de saccharose, 10 mM de CaCl2 et 50 mM cacodylate de sodium pour s'assurer que le gel reste solide et encapsule totalement les tissus lors de la fixation.
- Après traitement des tissus, intégrer l'ensemble de l'alginate-encapsulée morceau culture d'organe dans la paraffine et de la section avec un microtome à générer 5 sections um.
- L'alginate sera dissoute et retirée de la diapositive si performants immunohistochimie due à la chaleur de récupération d'antigène base. L'alginate restera aux taches et pour l'éosine en date hématoxyline et éosine.
4. Les résultats représentatifs:
Un exemple d'une culture d'organe en trois dimensions de l'ovaire et l'oviducte est montré dans la figure 1. Les ovaires peuvent être coupés en morceaux de taille différente, et l'OSE prolifèrent et migrent vers la surface de réparation qui a été blessé par l'incision avec le scalpel. Pendant ce processus, l'orientation correcte de l'OSE par rapport à la stroma sous-jacent est maintenu, avec l'OSE encapsulant l'ovaire. Comme le montre la figure 2, l'OSE des ovaires réduit de moitié d'encapsuler l'ovaire plus complètement par rapport aux ovaires coupés en quartiers ou des huitièmes. La réparation des plaies de l'ovairede surface peuvent être étudiés dans le contexte de l'ovaire entier et peut faire la lumière sur la façon dont la réparation de l'ovulation et de surface induit la transformation de surface de l'ovaire.
Le critère de l'expérience dépend de l'information qui est requise. Architecture des tissus, la morphologie cellulaire, et les taux de croissance cellulaire sont facilement contrôlés à l'aide des sections de paraffine. Par exemple, une seule couche de l'épithélium de surface de l'ovaire est observée après culture en milieu sans sérum aMEM pendant 7 jours (figure 3A), alors que plus de 5 ug / ml d'insuline pendant 7 jours induit une hyperprolifération de l'épithélium de surface de l'ovaire et la formation de plusieurs couches de cellules (figure 3B). En ajoutant bromodésoxyuridine aux cultures, à une concentration finale de 10 pM 24 heures avant la fixation, la prolifération des cellules peut être mesurée (en médaillon 3A et 3B). Pour les cultures maintenues dans le sérum sans aMEM, environ 3-5% de l'OSE subissent la prolifération pendant la période de 24 h étiquetage (3A en médaillon), tandis qu'un plus grand pourcentage de cellules de la granulosa prolifèrent. Ajout d'insuline pour les milieux de culture augmente le pourcentage de prolifération OSE à environ 30% du total des OSE (3B en médaillon). Immunofluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP) peuvent être visualisées à travers le gel d'alginate avec la microscopie standard après transfection d'ADNc (figure 3C). Alors que la culture d'organes alginate fournit de croissance et de l'analyse de l'épithélium de surface de l'ovaire et des follicules primaires, il convient de noter que la maturité, les follicules secondaires ne parviennent pas à survivre dans ce système de culture (figure 3D). Culture de follicules à maturité au sein d'une matrice d'hydrogel d'alginate a été décrit ailleurs 10.
Les altérations des protéines ou d'ARN peuvent être analysées à partir de l'organe entier ou de types cellulaires spécifiques en utilisant la dégradation enzymatique (figure 4). Traitement des organites ovariens cultivés avec de la collagénase quitte le stroma sous-jacent intact (figure 4C), tout en permettant l'enrichissement de l'OSE dans le culot cellulaire obtenu après le traitement, bien que certaines cellules stromales sont également isolés (figure 4D).
Figure 1. Ovaire de souris culture système en trois dimensions utilisé pour propager l'OSE après avoir blessé. A) Sous le microscope, la bourse et le tampon entourant la graisse ont été enlevés. B) des ovaires intacts (O) avec tube de l'oviducte (T) et graisses de pad (F). C) Ovaire avec Bursa et coussinet adipeux retirés (à gauche) et déroulé l'oviducte (à droite). D) organites ovaire ou l'oviducte ont été placés dans une goutte d'alginate. E) ont été enfermés organites alginate est tombé dans une solution de CaCl 2 réticulation de l'alginate pour former un gel. F) Alginate encapsulé organoïde ovaire. G) Alginate encapsulé organoïde oviducte. H) organites alginate encapsulé incubés dans un milieu de culture.
Figure 2. Surface régénérée par la surface de l'ovaire mesurée par cytokératine 8. L'encapsulation des organites ovariens par l'OSE, après avoir été coupé en huitièmes, quarts et demis, cultivées dans un milieu de BSA, et mesurée par une analyse immunohistochimique utilisant cytokératine 8 (CK8) anticorps.
Figure 3. Système de culture permet le passage d'alginate de facteurs de croissance et de transfection des ADNc dans l'OSE, mais ne supporte pas la croissance rapide et maturation des follicules. A) organoïde ovaire cultivées pendant 7 jours dans le milieu de base analysés pour l'expression CK8, qui marque l'OSE. En médaillon, la section de série colorées pour l'incorporation de BrdU. B) Ajout d'insuline pour les milieux de culture induit une hyperplasie de l'OSE. En médaillon, la section de série colorées pour l'incorporation de BrdU. C) organoïde ovaire transfectées avec l'ADNc pour exprimer la GFP. D) système de culture alginate soutient la croissance des follicules primordiaux (rouge pointe de flèche), mais pas la maturité des follicules secondaires (flèche noire).
Figure 4. OSE peut être isolé pour la culture analyse qui suit. A) organoïde cultivées dans un milieu pour un maximum de 2 semaines. B) organoïde encapsulé est traitée avec lyase d'alginate de quitter organoïde intacte. L'ovaire est tachée de CK8 pour marquer l'OSE. C) organoïde est traitée avec de la collagénase d'OSE séparer de stroma sous-jacent. Pièce de tissu restant était tachée de CK8 de mettre en évidence l'enlèvement de la surface de l'ovaire. D) les cellules recueillies après le traitement sont enrichis pour OSE que colorées pour CK8 (rouge). Les cellules sont contre-colorées avec du DAPI pour marquer les noyaux.
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Discussion
Le développement d'un système en trois dimensions d'orgue de la culture en utilisant des hydrogels d'alginate représente une méthode polyvalente pour analyser de nombreux types de tissus différents à partir d'un large éventail d'organismes. L'utilisation de cultures 3D peut être étendu aux domaines de l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative car il fournit un échafaudage sur lequel les cellules peuvent croître 11. Actuellement, notre laboratoire est en cours d'études initiales utilisant des ovaires et de tissus humains trompe de Fallope, mais la culture des droits humains et non humains follicules primates a été décrite 12,13.
L'utilisation d'hydrogels d'alginate pour organites culture offre plusieurs avantages sur les autres types d'hydrogels, comme celles du collagène incorporant, la fibrine, ou d'acide hyaluronique. Gels d'alginate à la température ambiante et à pH neutre, prévoyant peu de perturbations dans le tissu que le gel encapsule le 14 organoïde. Alginate ne réagit pas avec les protéines cellulaires, fournissant un support chimiquement inerte pendant 5 la croissance des tissus. Le gel peut être enzymatiquement dégradés lyase d'alginate à l'aide, qui ne dégrade pas les tissus encapsulés, permettant l'extraction des cellules cultivées 15. Un inconvénient de l'utilisation d'hydrogels d'alginate de culture de tissus en trois dimensions, c'est que la réticulation ionique fournissant un support mécanique pour l'hydrogel perd sa stabilité au fil du temps, ce qui nécessite des périodes de culture limitée et re-réticulation de l'alginate avant la fixation 5. Les aspects critiques de ce protocole sont le maintien de la stérilité tout au long du processus de culture, ainsi que la dissection minutieuse des ovaires et du tissu oviducte de prévenir les interruptions à la morphologie des tissus.
L'ovaire et l'oviducte sont particulièrement adaptés à cette méthode parce que l'épithélium de surface de l'ovaire cultivés sur des cellules en plastique culture traditionnelle subit rapidement transition épithélio mésenchymateuse, des changements morphologiques, et la mort cellulaire à moins immortalisé, par exemple par l'expression de SV40 T / T antigène ou hTERT 16, 17. Faible croissance de l'OSE normale sur le plastique empêche l'analyse de potentiellement précancéreuses changements. Le système de culture d'organe soutient aussi la croissance de l'épithélium de surface de l'ovaire ou de l'épithélium oviducte en contact avec les cellules stromales sous-jacentes, qui peuvent jouer un rôle dans la physiologie normale et malignes de la cells18. Culture de ces types de tissus dans les hydrogels d'alginate fournit un support mécanique pour maintenir l'architecture tridimensionnelle des tissus, tandis que le gel lui-même n'a pas d'interaction avec les 5 cellules.
En utilisant cette méthode pour l'épithélium de surface de culture de l'ovaire ou de l'épithélium oviducte permet une analyse des changements moléculaires et morphologiques résultant de manipulations isolés de la culture. Le système d'hydrogel d'alginate permet le libre passage des transfectées ADNc, siRNA, shRNA et, ainsi que des hormones et facteurs de croissance 19. Alors que la transfection transitoire n'est pas spécifique de l'OSE, parce que ce type de cellule est sur la surface extérieure de l'efficacité de transfection supérieur organoïde est réalisée dans l'OSE par rapport aux autres types de cellules à l'intérieur de l'ovaire, comme les cellules de la granulosa. L'incorporation de bromodésoxyuridine pendant la période de culture étiquettes divisant les cellules par la surveillance des changements dans la croissance cellulaire en réponse à des conditions expérimentales. Les changements moléculaires au niveau de l'ARN ou de protéine peut alors être déterminé à élucider les mécanismes conduisant à des changements néoplasiques.
Alors que l'étiologie exacte de cancer de l'ovaire est inconnue, une augmentation du nombre d'ovulations durée de vie ont montré une corrélation avec un risque accru de cancer de l'ovaire 20. Dans l'analyse in vivo des hypothèses reliant l'ovulation au cancer de l'ovaire présente de nombreux défis dans la détermination des contributions des gonadotrophines, la prolifération et l'inflammation et 21-23 cancérogenèse. La culture d'hydrogel d'alginate des ovaires et des trompes permet isolées, la comparaison directe de chacun de ces composants dans l'épithélium de surface de l'ovaire et de l'épithélium oviducte, conduisant à de nouvelles informations sur l'origine du cancer de l'ovaire et de sa progression à partir des cellules normales à des tumeurs.
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Disclosures
Il n'ya rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la recherche sur le cancer ovarien Fonds [accorder LT/UIC/01.2011], le Centre de l'UIC pour la science clinique et translationnelle, le Cancer Center UIC, et le National Institutes of Health octroi C06RR15482.
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par AAALAC sous protocoles approuvés par les soins des animaux protection des animaux et du Comité utilisation à l'UIC. Les animaux de ce projet sont logés dans des chambres barrière dans le laboratoire biologique Ressources (BRL) à l'Université de l'Illinois à Chicago. Le BRL dispose d'un personnel totalement vétérinaires qui surveille les animaux au moins deux fois par jour et fournit des conseils sur les soins aux animaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
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