Summary
Leptospiral प्रोटीन की सतह के जोखिम का आकलन करने के लिए एक कुशल विधि वर्णित है. विधि विशेष रूप से leptospiral कोशिकाओं के नाजुक बाहरी झिल्ली के विघटन से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया है. इस तकनीक को कई नकारात्मक नियंत्रण के रोजगार बाहरी झिल्ली और एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की विशिष्टता की अखंडता का आकलन करने के लिए की आवश्यकता है.
Protocol
1. लेप्टोस्पाइरा की गिलास स्लाइड के लिए फिक्सेशन
- लेप्टोस्पाइरा interrogans एक वर्ग BSL2 रोगज़नक़ है. जीवित कोशिकाओं के साथ कार्य करना उचित हैंडलिंग, जैसे दस्ताने, प्रयोगशाला कोट पहने हुए और एक बाँझ में हुड pipetting चरणों की आवश्यकता है.
- Medium11 EMJH में लेप्टोस्पाइरा आगे बढ़ें, 30 डिग्री सेल्सियस जब तक वे के मध्य तक पहुँचने के लिए देर से लगभग 6 दिनों के लिए लॉग चरण (घनत्व 5 10 x 7 x 5 8 10 कोशिकाओं / एमएल). पर 1% खरगोश सीरम के साथ पूरक
- कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए ~ 2000 XG पर centrifugation द्वारा संस्कृति हार्वेस्ट.
- आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे फॉस्फेट में गोली resuspend खारा (पीबीएस) -5 मिमी buffered 5 x 10 8 कोशिकाओं / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता 2 MgCl, pH7.2.
- दो अच्छी तरह चैम्बर गिलास स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 30 पर सेते ° 80 मिनट के लिए सी कोशिकाओं को पालन करने के लिए अनुमति देते हैं.
- ध्यान से युक्त तरल आकांक्षा से अनबाउंड कोशिकाओं को हटा दें.
- गिलास स्लाइड के लिए 1 / PBS-5 मिमी 2 MgCl में 2% की paraformaldehyde की अच्छी तरह से मिलीलीटर जोड़कर शेष बरकरार बैक्टीरिया को ठीक करें. 30 पर 40 मिनट के लिए सेते ° सी. इन स्लाइड्स सतह उजागर प्रोटीन के मूल्यांकन के लिए किया जाएगा.
- नियंत्रण प्रोटीन - उप सतह का आकलन स्लाइड्स के लिए, 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 100 के बहुत ठंडा मेथनॉल% के साथ फिक्सिंग से बाहरी झिल्ली permeabilize. -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. मेथनॉल कई मायनों में काम करता है: यह बाहरी झिल्ली permeabilizes, प्रोटीन denaturates, और गिलास स्लाइड के लिए फिक्स कोशिकाओं.
- आकांक्षा से एजेंट फिक्सिंग निकालें.
2. विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल
- / अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर (Difco लेप्टोस्पाइरा संवर्धन EMJH) के 1 मिलीलीटर जोड़कर गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक. 30 ° C पर 90 मिनट के लिए सेते हैं.
- विशिष्ट एंटीबॉडी (प्रतिरक्षा खरगोश सीरा या माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, यहाँ पॉलीक्लोनल खरगोश OmpL54 10 के लिए विशिष्ट सीरा, FlaA1 12, और OmpL1 13) और पूर्व प्रतिरक्षा खरगोश सीरा या माउस तपस्वी नहीं एंटीबॉडी युक्त तरल पदार्थ (जब नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग) में पतला बफर अवरुद्ध. प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए dilutions empirically एंटीबॉडी टिटर पर निर्भर करता है, प्रतिजन - एंटीबॉडी और सेल में प्रोटीन की बहुतायत जेट निर्धारित किया है. सामान्य रेंज 01:50 1:600 है.
- आकांक्षा द्वारा अवरुद्ध बफर निकालें और 1 / अच्छी तरह से मिलीलीटर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें.
- 1 के लिए 30 ° C पर सेते हैं.
- तरल आकांक्षा से निकालें और पीबीएस (1 मिलीलीटर अच्छी तरह /) के साथ तीन बार कुओं धो लो.
3. Leptospires के दृश्य
- जोड़ें 1 / अच्छी तरह से मिलीलीटर Alexa 488 माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल (या तो विरोधी खरगोश बकरी आईजीजी बकरी या माउस - आईजीजी विरोधी) Fluor पतला 1:2000 और फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग, 4'6 - diamidino 2 - फिनाइल - इण्डोल dihydrochloride ( DAPI) 0.25 μg / बफर अवरुद्ध में मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पतला. यह कदम एंटीबॉडी बंधनकारी और सभी एंटीबॉडी के स्वतंत्र spirochetes बाध्यकारी क्रमशः की उपस्थिति का पता लगाने सुनिश्चित करता है.
- 30 में स्लाइड्स सेते डिग्री सेल्सियस 45 मिनट के लिए.
- तरल आकांक्षा से निकालें और कुओं आसुत जल (1 मिलीलीटर अच्छी तरह /) के साथ पीबीएस के साथ दो बार और एक बार धोने.
- कक्षों और गिलास स्लाइड और हवा ~ 10 मिनट के लिए सूखी से चिपकने वाली पट्टी निकालें.
- गोल्ड विरोधी फीका बढ़ते मध्यम (स्लाइड प्रति 2 एक्स 20 μl) और एक 24 x 50 मिमी को कवर पर्ची लम्बा जोड़ें.
- रात भर अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं. यह कदम बढ़ते मध्यम (कठोर) इलाज करने के लिए अनुमति आवश्यक है.
- नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची सील.
- DAPI के लिए एक / सियान नीले पता लगाने फिल्टर और एलेक्सा Fluor 488 के लिए एक हरे रंग का पता लगाने फिल्टर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा धुंधला कल्पना. सुनिश्चित करना है कि नमूनों की एक सटीक प्रतिनिधित्व किया जाता है, सुनिश्चित करें कि आप प्रत्येक नमूना के लिए पूरे चैम्बर क्षेत्र मूल्यांकन.
- प्रत्येक नमूना के लिए एक प्रतिनिधि के क्षेत्र इमेजिंग द्वारा डेटा रिकॉर्ड. जब इमेजिंग Alexa Fluor 488 प्रतिदीप्ति, सभी नमूनों के लिए एक ही जोखिम समय का उपयोग करें. एक सुसंगत जोखिम समय का उपयोग परीक्षण प्रतिजनों बनाम नियंत्रण के साथ परिणामों के और अधिक सटीक तुलना की अनुमति देगा.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
लेप्टोस्पाइरा interrogans सतह और उप सतह प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं के साथ सतह आइएफए परिणामों के उदाहरण हैं चित्रा 2 में दिखाया जाता है. एक परीक्षण सकारात्मक माना जाता है जब पर्याप्त प्रतिदीप्ति बरकरार leptospires साथ नमूनों में ब्याज की एक प्रोटीन है कि सतह संपर्क में है (2A छवि) के लिए पता चला है. आमतौर पर, एक सकारात्मक परीक्षण (यहाँ, OmpL54 सतह उजागर) में, लगभग एक ही प्रतिदीप्ति तीव्रता बरकरार है और दोनों permeabilized कोशिकाओं में मनाया जाता है (2A छवि) यह आवश्यक है एक उपसतह के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर बाहरी झिल्ली अखंडता के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल , अधिमानतः periplasmic प्रोटीन (जैसे leptospiral FlaA1, अंजीर 2B). केवल जब डेटा बताते हैं कि बाहरी झिल्ली बरकरार duri बनी हुई हैएनजी प्रयोग, यानी एक उप सतह प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी बरकरार कोशिकाओं (कोई प्रतिदीप्ति या जब permeabilized नमूना के रूप में छवि में की तुलना में बहुत कमजोर प्रतिदीप्ति 2B.) के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं करते, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि ब्याज की प्रोटीन (ओं) है सतह उजागर. पूर्व प्रतिरक्षा सीरा (पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के मामले में) के साथ एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोगों के शामिल स्पष्ट डेटा के लिए आवश्यक है और बरकरार या permeabilized कोशिकाओं (छवि 2A, 2C) में पर्याप्त प्रतिदीप्ति नहीं उपज चाहिए. दाग DAPI leptospires कल्पना जब नकारात्मक परिणाम (कोई Alexa Fluor प्रतिदीप्ति 488) मनाया जाता है आवश्यक है. Propidium आयोडाइड के साथ Counterstaining DAPI के लिए एक स्वीकार्य विकल्प है.
इस विधि बल्कि गुणात्मक उज्जवल प्रतिदीप्ति के रूप में मात्रात्मक कई सतह के कारण प्रतिजनी जा रहा है एक एकल प्रतिजन बराबर बहुतायत के अन्य प्रतिजनों के सापेक्ष लेकिन कम सतह उजागर epitopes के साथ मान्यता प्राप्त epitopes उजागर हो सकता है. इसलिए प्रतिदीप्ति तीव्रता केवल बरकरार बनाम विभिन्न प्रोटीन के बीच permeabilized और कोशिकाओं नहीं प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में एक ही एंटीबॉडी के जेट की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह अंतर महत्वपूर्ण है जब एक अस्पष्ट परिणाम प्राप्त की है जहां permeabilized कोशिकाओं (छवि 2C) की तुलना में काफी कम प्रतिदीप्ति बरकरार कोशिकाओं में मनाया जाता है. इस तरह के एक परिणाम यह इंगित करता है कि या तो प्रोटीन एक उप सतह स्थान में है (कुछ गैर विशिष्ट बरकरार कोशिकाओं की पृष्ठभूमि धुंधला के साथ), एंटीबॉडी preferentially गैर देशी epitopes है कि मेथनॉल permeabilization या एक प्रोटीन के बाद उजागर कर रहे हैं बाध्य कर रहे हैं एकाधिक हो सकता है स्थानीयकरण साइटों के रूप में एक और spirochete, Borrelia burgdorferi 14 ईआरपी और ELP प्रोटीन के लिए में वर्णित है. या तो मामले में, इस तरह के रूप में एक अस्पष्ट आइएफए परिणाम सतह biotinylation या सतह proteolysis जैसे वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता है निर्धारित करने के लिए है कि ब्याज की प्रोटीन सतह उजागर या नहीं 10 है.
चित्रा 1. लेप्टोस्पाइरा interrogans spirochetes के इम्युनो - प्रतिदीप्ति परख की सतह के लिए फ्लो चार्ट . सबसे पहले, सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर दो अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाता है (एक प्रयोग के लिए कम से कम दो स्लाइड्स) और पालन leptospires के लिए incubated. अगला, leptospires बरकरार बाहरी झिल्ली (ओम) और permeabilized ओम के साथ नमूने के लिए 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 100% ठंड मेथनॉल के साथ नमूने के लिए 1 / 2% paraformaldehyde (पीएफए) के अच्छी तरह से मिलीलीटर जोड़कर चैम्बर स्लाइड्स के लिए तय कर रहे हैं. अगला, leptospires पर 30 उपसतह (प्राथमिक अब) प्रोटीन ° सी 90 मिनट के लिए के लिए नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ साथ सतह उजागर प्रोटीन को पहचानने एंटीबॉडी के साथ incubated हैं. फिर, प्राथमिक एंटीबॉडी / एलेक्सा Fluor 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी की अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर के साथ ऊष्मायन द्वारा पता चला रहे हैं. अंत में, कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे हैं.
चित्रा 2. Leptospiral प्रोटीन की सतह immunofluorescence विश्लेषण. लेप्टोस्पाइरा interrogans spirochetes प्रतिरक्षा और पूर्व प्रतिरक्षा सीरा के साथ जांच रहे थे, और नकारात्मक परिणामों DAPI counterstain के साथ रखा गया spirochetes की उपस्थिति का प्रदर्शन. एक हरी प्रतिदीप्ति फिल्टर Alexa 488 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी उजागर प्रोटीन और नीले / सियान प्रतिदीप्ति फिल्टर सतह कोशिका के डीएनए के लिए बाध्य DAPI का पता लगाने के लिए बाध्यकारी Fluor का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ए) Leptospires एक सतह प्रोटीन उजागर, 10 OmpL54 पहचानने एंटीबॉडी के साथ जांच. बी) कक्ष periplasmic उपसतह प्रोटीन, FlaA1 (नकारात्मक नियंत्रण) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच. सी) कक्ष leptospiral porin, OmpL1 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच. खरगोश leptospires के लिए सीरा के बंधन Alexa Fluor 488 संयुग्मित विरोधी खरगोश बकरी आईजीजी टुकड़े के साथ पाया गया. सभी छवियों 4 सेकंड लंबे समय प्रदर्शन के बाद लिया जाता है.
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Discussion
हमारी सतह आइएफए तकनीक विभिन्न borrelial 15, 16 और 12 leptospiral 17 प्रोटीन की सतह के जोखिम को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि करने के लिए इसी तरह की है. सतह आइएफए विधि का विवरण यहाँ वर्णित जबकि गिलास स्लाइड का पालन लेप्टोस्पाइरा कोशिकाओं की प्रवृत्ति का लाभ लेने के बाहरी झिल्ली अखंडता बनाए रखने के प्रयास में कोशिकाओं में हेरफेर कम से कम करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. विधि paraformaldehyde की एक कम एकाग्रता, (4% बनाम 2%) पहले प्रकाशित 12 प्रोटोकॉल, 17 से अधिक बाहरी झिल्ली स्थिर बफर (पीबीएस 5 मिमी MgCl 2) और कम धोने कदम के साथ धोने शामिल है. इसके अलावा, हमारे सतह आइएफए विधि नियंत्रण है कि सटीक डाटा व्याख्या के लिए आवश्यक हैं के महत्व पर जोर दिया. विधि का एक और सीमा है कि यह विशिष्ट एंटीबॉडी कि पहचानने का मिलान (ओं) के हित के प्रोटीन की सतह उजागर करने में सक्षम हैं की उपलब्धता की आवश्यकता है. कुछ मामलों में, अन्य सतह प्रोटीन या lipopolysaccharides द्वारा steric बाधा एंटीबॉडी प्रतिजन गठन को रोका जा सकता है. फिर भी, सतह आइएफए विधि सीधे प्रोटीन की सतह के जोखिम का आकलन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है और या तो एक अकेले खड़े दृष्टिकोण के रूप में या immunogold लेबलिंग, सतह proteolysis, आदि जैसे अन्य तकनीकों के साथ संगीत कार्यक्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन में सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था एअर इंडिया नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों से और वीए मेडिकल रिसर्च फंड (दाह के लिए) द्वारा 34,431 (दाह के लिए).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
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