Summary
Een efficiënte methode om het oppervlak-blootstelling van leptospiral eiwitten te bepalen is beschreven. De methode is speciaal ontworpen om verstoring van de kwetsbare buitenste membraan van leptospiral cellen te voorkomen. Deze techniek vergt inzet van een aantal negatieve controles te beoordelen van de integriteit van de buitenste membraan en de specificiteit van de antistof reactie.
Abstract
Bacteriële oppervlakte-eiwitten betrokken zijn bij direct contact met gastheercellen en in de opname van voedingsstoffen uit het milieu 1. Om deze reden kan cellulaire lokalisatie geven inzicht in de functionele rol van bacteriële eiwitten. Oppervlak lokalisatie van bacteriële eiwitten is een belangrijke stap op weg naar de identificatie van virulentiefactoren betrokken bij mechanismen van pathogeniteit.
Methoden voor het fractioneren leptospiral membranen 02-05 mei selectief zijn voor een bepaalde klasse van de buitenste membraan-eiwitten (Omps), zoals lipoproteïnen versus transmembrane Omps, en dus leiden tot misclassificatie. Dit waarschijnlijk is te wijten aan structurele verschillen en hoe ze worden geassocieerd met de buitenste membraan. Lipoproteïnen worden geassocieerd met membranen via een hydrofobe interactie tussen de N-terminale lipide-groep (drie vetzuren) en het lipide bilaag fosfolipiden 6, 7. In tegenstelling, zijn transmembraan Omps meestal geïntegreerd in de lipide bilaag door amfipathisch β-sheets die in een vat-achtige structuur 8, 9. Bovendien betekent de aanwezigheid van een eiwit in de buitenste membraan niet per se garanderen dat het eiwit of haar domeinen worden blootgesteld aan de oppervlakte. Spirochetal buitenste membranen is bekend dat ze kwetsbaar en dit betekent dat methoden waarbij zachte manipulatie van cellen en opneming van sub-oppervlakte-eiwit regelt het beoordelen van de integriteit van de buitenste membraan.
Hier presenteren we een immunofluorescentie assay (IFA) methode om rechtstreeks te beoordelen oppervlak blootstelling van eiwitten op intact leptospiren. Deze methode is gebaseerd op de erkenning van leptospiral oppervlakte-eiwitten door antigeen-specifieke antilichamen. Hierin worden antilichamen specifiek voor OmpL54 10 detetcted aftero binding aan native, het oppervlak blootgesteld epitopen. Vergelijking van antilichaamreactiviteit intact versus gepermeabiliseerde cellen in staat stelt de evaluatie van de cellulaire distributie en het al dan niet een eiwit selectief aanwezig is op leptospiral oppervlak. De integriteit van de buitenste membraan moet worden beoordeeld met behulp van antilichamen tegen een of meer ondergrondse proteïnen, bij voorkeur gelegen in het periplasma.
Het oppervlak IFA-methode kan worden gebruikt om het oppervlak blootstelling van elke leptospiral eiwit waaraan specifieke antilichamen beschikbaar te analyseren. Zowel het nut en de beperking van de methode hangt af van de vraag of de gebruikte antilichamen kunnen binden de inheemse epitopen. Omdat antilichamen vaak worden opgewekt tegen recombinante eiwitten, epitopen van inheemse, oppervlakte-eiwitten kunnen worden blootgesteld niet worden herkend. Toch is het oppervlak IFA-methode is een waardevol instrument voor het bestuderen van onderdelen van intacte bacteriële oppervlakken. Deze methode kan worden toegepast, niet alleen voor leptospiren, maar ook andere spirocheten en gramnegatieve bacteriën. Voor een sterkere conclusies ten aanzien van oppervlakte-blootstelling van Omps, is een integrale aanpak, waarbij verschillende mobiele lokalisatie methoden aanbevolen 10.
Protocol
1. Fixatie van Leptospira aan objectglaasjes
- Leptospira interrogans is een klasse BSL2 ziekteverwekker. Het werken met levende cellen het vereist behoren worden behandeld, zoals het dragen van handschoenen, lab-jas en pipetteren stappen in een steriele-kap.
- Groeien Leptospira in EMJH medium11, aangevuld met 1% konijnenserum op 30 ° C tot het bereiken van midden-tot late-log fase (dichtheid van 5 x 10 7 tot 5 x 10 8 cellen / ml) voor ongeveer 6 dagen.
- Oogst de cultuur door centrifugatie bij ~ 2000 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en voorzichtig de pellet opnieuw in suspensie in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 8 cellen / ml.
- Voeg 1 ml celsuspensie aan elke well van de twee-kamer goed glas dia's en incubeer bij 30 ° C voor 80 minuten, zodat cellen te hechten.
- Verwijder voorzichtig de vloeistof met een niet-gebonden cellen door aspiratie.
- Fix resterende intacte bacteriën tot glas dia's door toevoeging van 1 ml / putje van 2% paraformaldehyde in PBS-5 mM MgCl 2. Incubeer 40 min bij 30 ° C. Deze dia's zal zijn voor de beoordeling van het oppervlak belicht eiwitten.
- Voor controle dia's beoordelen sub-oppervlakte-eiwitten, permeabilize de buitenste membraan door de vaststelling van met 1 ml / putje van 100% ijskoude methanol. Incubeer bij -20 ° C gedurende 20 minuten. Methanol werkt op verschillende manieren: het permeabilizes de buitenste membraan, denaturates de eiwitten, en repareert cellen glas dia's.
- Verwijder fixeermiddelen door aspiratie.
2. Labeling met specifieke antilichamen
- Blokkeer niet-specifieke binding door het toevoegen van 1 ml / putje van het blokkeren van buffer (Difco Leptospira verrijking EMJH). Incubeer bij 30 ° C gedurende 90 minuten.
- Verdun de specifieke antilichaam (immuun sera konijn of muis monoklonale antilichamen, hier polyklonale konijnen sera specifiek voor OmpL54 10, FlaA1 12, en OmpL1 13) en pre-immuun sera konijn of muis ascetische vloeistof, die geen antilichaam (wanneer gebruikt als negatieve controle) in blokkerende buffer. Verdunningen voor elk antilichaam moeten worden bepaald empirisch afhankelijk van de antilichaam titer, antigeen-antilichaam reactiviteit en de grootte van eiwit in de cel. De gebruikelijke assortiment is 1:50 tot 1:600.
- Verwijder de blokkering buffer door aspiratie en voeg 1 ml / putje van verdunde primaire antilichamen.
- Incubeer bij 30 ° C voor 1 uur.
- Verwijder de vloeistof door aspiratie en wassen van de putjes drie keer met PBS (1 ml / putje).
3. Visualisatie van leptospiren
- Voeg 1 ml / putje van Alexa Fluor 488-gelabelde secundaire antilichamen (hetzij geit anti-konijn IgG of geit anti-muis IgG) verdund 1:2000 en fluorescerende nucleïnezuur vlek, 4'6-diamidino-2-fenyl-indool dihydrochloride ( DAPI), verdund tot een uiteindelijke concentratie van 0,25 ug / ml in het blokkeren van buffer. Deze stap zorgt voor de detectie van antilichamen binden en de aanwezigheid van alle spirocheten onafhankelijk van antilichaambinding, respectievelijk.
- Incubeer de glaasjes op 30 ° C gedurende 45 minuten.
- Verwijder de vloeistof door aspiratie en was de putten tweemaal met PBS en een keer met gedestilleerd water (1 ml / putje).
- Verwijder de kamers en de plakstrook van het glas dia's en drogen voor ~ 10 minuten.
- Voeg ProLong Gold anti-fade montage medium (2 x 20 ul per dia) en een 24 x 50 mm dekglas.
- Incubeer overnacht bij kamertemperatuur in het donker. Deze stap is noodzakelijk om de montage medium om te genezen (harden).
- Dicht het dekglas met nagellak.
- Visualiseer de kleuring met behulp van fluorescentie microscopie een cyaan / blauw detectie filter voor DAPI en een groen filter voor detectie Alexa Fluor 488. Om te zorgen dat een nauwkeurige weergave van de monsters wordt gemaakt, zorg ervoor dat je de hele kamer gebied te evalueren voor elk monster.
- Noteer de gegevens door beeldvorming een vertegenwoordiger veld voor elk monster. Bij de beeldvorming Alexa Fluor 488 fluorescentie, dezelfde belichtingstijd voor alle monsters te gebruiken. Met behulp van een consistente belichtingstijd zal nauwkeuriger vergelijking van de resultaten met test antigenen ten opzichte van controles.
4. Representatieve resultaten:
Voorbeelden van het oppervlak IFA resultaten met Leptospira interrogans cellen met behulp van antilichamen tegen het oppervlak en de sub-oppervlakte-eiwitten zijn weergegeven in figuur 2. Een test wordt als positief beschouwd wanneer substantieel fluorescentie wordt gedetecteerd in monsters met een intacte leptospiren voor een eiwit van belang dat het oppervlak is blootgesteld (fig. 2A). Meestal, in een positieve test (in dit geval het oppervlak blootgestelde OmpL54), is ongeveer gelijk fluorescentie-intensiteit waargenomen in zowel de intacte en gepermeabiliseerd cellen (Fig. 2A) is essentieel om ook een negatieve controle voor de buitenste membraan integriteit met behulp van antilichamen tegen een ondergrond , bij voorkeur periplasmatische eiwit (bijv. leptospiral FlaA1, Fig. 2B). Alleen wanneer de gegevens blijkt dat de buitenste membraan intact is gebleven During van het experiment, dat wil zeggen antilichamen tegen een sub-oppervlakte-eiwit niet reageren op intacte cellen (geen fluorescentie of veel zwakker fluorescentie in vergelijking met gepermeabiliseerde monster als in Fig. 2B), kan worden geconcludeerd dat het eiwit (s) van belang is oppervlak blootgesteld. Opname van experimenten met pre-immuun sera (in het geval van polyklonale antilichamen) als een extra negatieve controle is van essentieel belang voor eenduidige gegevens en dient substantieel fluorescentie niet toegeven in intacte of gepermeabiliseerde cellen (Fig. 2A, 2C). DAPI vlek is nodig om leptospiren visualiseren als een negatief resultaat (geen Alexa Fluor 488 fluorescentie) in acht worden genomen. Tegenkleuring met propidiumjodide is een aanvaardbaar alternatief voor DAPI.
Deze methode is eerder kwalitatief dan kwantitatief als helderder fluorescentie kan te wijten zijn aan meerdere oppervlakte blootgesteld antigene epitopen worden herkend in een enkele antigeen ten opzichte van andere antigenen van gelijke overvloed, maar met minder oppervlakte bloot epitopen. Daarom is de fluorescentie-intensiteiten kan alleen worden gebruikt om reactiviteit van dezelfde antilichamen, zoals intacte versus gepermeabiliseerde cellen en niet fluorescentie-intensiteiten tussen de verschillende eiwitten te vergelijken. Dit onderscheid is belangrijk bij een dubbelzinnig resultaat wordt verkregen, waar aanzienlijk minder fluorescentie wordt waargenomen in intacte cellen dan in gepermeabiliseerde cellen (Fig. 2C). Een dergelijk resultaat geeft aan dat ofwel het eiwit is in een ondergrondse ligging (met een aantal niet-specifieke achtergrond kleuring van intacte cellen), de antilichamen binden bij voorkeur aan niet-native epitopen die zijn blootgesteld na methanol permeabilisatie of een eiwit zou kunnen hebben meerdere lokalisatie sites als beschreven voor Erp en Elp eiwitten van een ander spirocheet, Borrelia burgdorferi 14. In beide gevallen is een dubbelzinnige IFA resultaat, zoals dit vereist alternatieve methoden zoals oppervlakte biotinylatie of oppervlak proteolyse om te bepalen of het eiwit van belang is het oppervlak-blootgesteld of niet 10.
Figuur 1. Stroomdiagram voor de oppervlakte immuno-fluorescentie assay van Leptospira interrogans spirocheten. Ten eerste is 1 ml celsuspensie toegevoegd aan elke well van de twee-kamer goed slides (ten minste twee dia's voor elk experiment) en geïncubeerd gedurende leptospiren te houden. Vervolgens worden leptospiren bevestigd aan kamer dia's door toevoeging van 1 ml / putje van 2% paraformaldehyde (PFA) voor monsters met intacte buitenste membraan (OM) en 1 ml / putje van 100% koude methanol voor monsters met gepermeabiliseerde OM. Vervolgens worden leptospiren geïncubeerd met antilichamen die het oppervlak blootgestelde eiwitten samen met de controle antilichamen voor ondergrondse eiwitten (Primary Ab's) bij 30 ° C gedurende 90 minuten. Vervolgens worden de primaire antilichamen gedetecteerd door incubatie met 1 ml / putje van Alexa Fluor 488 geconjugeerde secundaire antilichamen. Tot slot, cellen zijn gevisualiseerd door fluorescentie microscopie.
Figuur 2. Surface immunofluorescentie analyse van leptospiral eiwitten. Leptospira interrogans spirocheten waren gemerkt met immuun-en pre-immuun sera, en negatieve resultaten werden gekoppeld aan een DAPI tegenkleuring om de aanwezigheid van spirocheten aan te tonen. Een groene fluorescentie filter werd gebruikt om de Alexa Fluor 488 gelabeld secundair antilichaam binden aan blootgesteld, eiwitten en blauw / cyaan fluorescentie filter oppervlak om DAPI binding aan DNA te detecteren detecteren. A) leptospiren gemerkt met antilichamen die een oppervlakte blootgesteld eiwit, OmpL54 10. B) De cellen gemerkt met antilichamen tegen een periplasmatische ondergrond eiwit, FlaA1 (negatieve controle). C) De cellen gemerkt met antilichamen tegen leptospiral Porin, OmpL1. Binding van konijn sera om leptospiren werden gedetecteerd met Alexa Fluor 488 geconjugeerd geit anti-konijn IgG fragmenten. Alle beelden zijn genomen na 4 sec lange blootstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze oppervlak IFA techniek is vergelijkbaar met die gebruikt om het oppervlak blootstelling van de verschillende borrelial 15, 16 en leptospiral 12, 17 eiwitten aan te tonen. De details van het oppervlak IFA hier beschreven methode zijn ontworpen om het manipuleren van cellen te minimaliseren in een poging om buitenste membraan integriteit te behouden terwijl u profiteert van de neiging van Leptospira cellen zich te houden aan glas dia's. Bij deze methode wordt een lagere concentratie (2% versus 4%) van de paraformaldehyde, wassen met buitenste membraan stabiliserende buffer (PBS +5 mm MgCl 2) en minder wasstappen dan eerder gepubliceerde protocollen 12, 17. Bovendien, onze oppervlakte IFA-methode benadrukt het belang van controles die essentieel zijn voor een nauwkeurige data-interpretatie. Een beperking van de methode is dat het de beschikbaarheid van specifieke antilichamen die in staat zijn te herkennen aan het oppervlak blootgestelde epitoop (s) van het eiwit van belang vereist. In sommige gevallen kan sterische hinder door andere oppervlakte-eiwitten of lipopolysacchariden voorkomen antilichaam-antigen formatie. Toch is het oppervlak IFA-methode is een relatief eenvoudig techniek om direct het beoordelen van het oppervlak blootstelling van eiwitten en kan worden gebruikt als een stand alone aanpak of in samenwerking met andere technieken, zoals immunogold etikettering, oppervlakte proteolyse, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de GGD te verlenen AI-34.431 (tot DAH) van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten en door VA Medical Research Funds (tot DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M.
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A.
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A.
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
