Summary
Une méthode efficace pour évaluer l'exposition en surface des protéines de leptospires est décrite. La méthode est spécifiquement conçue pour éviter toute perturbation de la membrane externe des cellules fragiles de leptospires. Cette technique nécessite l'emploi de plusieurs contrôles négatifs pour évaluer l'intégrité de la membrane externe et la spécificité de la réaction d'anticorps.
Abstract
Protéines de surface bactériennes sont impliqués dans le contact direct avec les cellules hôtes et de l'absorption des nutriments provenant de l'environnement 1. Pour cette raison, la localisation cellulaire peut fournir des indications sur le rôle fonctionnel des protéines bactériennes. Localisation à la surface des protéines bactériennes est une étape clé vers l'identification des facteurs de virulence impliqués dans les mécanismes de pathogénicité.
Méthodes de fractionnement de leptospires 2-5 membranes peuvent être sélectif pour une certaine classe de protéines de la membrane externe (OMP), telles que les lipoprotéines vs OMP transmembranaire, et donc conduire à une classification erronée. C'est probablement ce qui est dû à des différences structurelles et comment elles sont associées à la membrane externe. Les lipoprotéines sont associés aux membranes par une interaction hydrophobe entre le fragment N-terminal de lipides (trois acides gras) et les phospholipides bicouche lipidique 6, 7. En revanche, les OMP transmembranaires sont généralement intégrés dans la bicouche lipidique par amphipathiques β-feuilles disposées dans une structure en tonneau, comme 8, 9. En outre, la présence d'une protéine dans la membrane externe, ne garantit pas nécessairement que la protéine ou ses domaines sont exposés à la surface. Spirochetal membranes externes sont connus pour être des méthodes fragile et nécessite donc impliquant une manipulation douce des cellules et l'inclusion de sous-surface de la protéine de contrôle pour évaluer l'intégrité de la membrane externe.
Ici, nous présentons une technique d'immunofluorescence (IFA) méthode pour évaluer directement l'exposition sur la surface des protéines intactes leptospires. Cette méthode est basée sur la reconnaissance des protéines de surface de leptospires par l'antigène-anticorps spécifiques. Ici, des anticorps spécifiques pour OmpL54 10 sont detetcted aftero se liant à des épitopes natifs de surface, exposée. Comparaison de la réactivité des anticorps aux cellules intactes par rapport perméabilisées permet d'évaluer la distribution cellulaire et si oui ou non une protéine est sélectivement présents sur la surface de leptospires. L'intégrité de la membrane externe devrait être évaluée à l'aide d'anticorps à un ou plusieurs protéines de subsurface, situé de préférence dans le périplasme.
La méthode de la surface IFA peut être utilisé pour analyser l'exposition en surface d'une protéine de leptospires à laquelle les anticorps spécifiques sont disponibles. Tant l'utilité et la limitation de la méthode dépend de savoir si les anticorps utilisés sont capables de se lier à des épitopes natifs. Puisque les anticorps sont souvent soulevés contre les protéines recombinantes, les épitopes des indigènes, exposées à la surface des protéines peuvent ne pas être reconnu. Néanmoins, la méthode de la surface IFA est un outil précieux pour l'étude des composantes de la surface intacte bactérienne. Cette méthode peut être appliquée non seulement pour les leptospires, mais aussi d'autres spirochètes et les bactéries gram-négatives. Pour plus fortes conclusions concernant surface d'exposition de OMP, une approche globale impliquant plusieurs méthodes de localisation cellulaire est recommandé 10.
Protocol
1. Fixation des lames de verre Leptospira
- Leptospira interrogans est une classe BSL2 pathogène. Travailler avec des cellules vivantes elle nécessite la manipulation appropriées, telles que porter des gants, sarrau et les étapes de pipetage dans une hotte stérile.
- Cultivez Leptospira dans EMJH medium11, supplémentés avec du sérum de lapin 1% à 30 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent la mi-à fin phase logarithmique (densité de 5 x 10 7 à 5 x 10 8 cellules / ml) pendant environ 6 jours.
- Récolte de la culture par centrifugation à 2000 xg ~ pendant 7 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant par aspiration et doucement resuspendre le culot dans un tampon phosphate salin (PBS) -5 mM MgCl 2, pH 7,2 à une concentration finale de 5 x 10 8 cellules / ml.
- Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits de deux lames de verre et de chambre et incuber à 30 ° C pendant 80 min pour permettre aux cellules d'adhérer.
- Retirer délicatement le liquide contenant des cellules non liée par aspiration.
- Fix restantes bactéries intactes des lames de verre en ajoutant 1 ml / puits de paraformaldéhyde à 2% dans du PBS-5 MgCl 2 mM. Incuber pendant 40 min à 30 ° C. Ces lames seront d'évaluation des exposés en surface des protéines.
- Pour évaluer les lames de contrôle de sub-surface des protéines, perméabiliser la membrane externe, en fixant à 1 ml / puits de 100% du méthanol glacé. Incuber à -20 ° C pendant 20 min. Le méthanol agit de plusieurs façons: il perméabilise la membrane externe, denaturates les protéines et les cellules des correctifs pour des lames de verre.
- Retirez la fixation des agents par aspiration.
2. Le marquage avec des anticorps spécifiques
- Bloc liaison non spécifique en ajoutant 1 ml / puits de tampon de blocage (Difco Leptospira enrichissement EMJH). Incuber à 30 ° C pendant 90 min.
- Diluer l'anticorps spécifique (lapin immunsérums ou d'anticorps monoclonaux de souris, sérums de lapin ici polyclonaux spécifiques pour OmpL54 10, FlaA1 12, et OmpL1 13) et pré-immuns sérums de lapins fluides ascétiques ou la souris ne contenant pas d'anticorps (lorsque utilisé comme contrôle négatif) dans tampon de blocage. Les dilutions pour chaque anticorps doivent être déterminées empiriquement en fonction de titrage d'anticorps, antigène-anticorps de réactivité et de l'abondance de la protéine dans la cellule. La gamme habituelle est de 1:50 à 1:600.
- Retirez le tampon de blocage par aspiration et ajouter 1 ml / puits d'anticorps primaires dilués.
- Incuber à 30 ° C pendant 1h.
- Retirer le liquide par aspiration et laver les puits trois fois avec du PBS (1 ml / puits).
3. Visualisation des leptospires
- Ajouter 1 ml / puits d'Alexa Fluor 488 anticorps secondaires marqués (soit de chèvre anti-IgG de lapin ou de chèvre anti-IgG de souris) dilué 1:2000 et fluorescentes acide nucléique tache, 4'6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate ( DAPI) dilué à une concentration finale de 0,25 ug / ml dans le tampon de blocage. Cette étape assure la détection de liaison à l'anticorps et la présence de tous les spirochètes indépendant de fixation des anticorps, respectivement.
- Incuber les lames à 30 ° C pendant 45 min.
- Retirer le liquide par aspiration et laver les puits deux fois avec du PBS et une fois avec de l'eau distillée (1 ml / puits).
- Retirez les chambres et la bande adhésive de la lame de verre et d'air sec pendant environ 10 min.
- Ajouter Prolongez Or anti-fade milieu de montage (2 x 20 pi par diapositive) et un 24 x 50 mm lamelle.
- Incuber une nuit à température ambiante dans l'obscurité. Cette étape est nécessaire pour permettre le support de montage pour guérir (durcir).
- Sceau de la lamelle avec du vernis à ongles.
- Visualisez la coloration par microscopie à fluorescence en utilisant une détection cyan / bleu filtre pour DAPI et un filtre de détection vert pour Alexa Fluor 488. Afin de s'assurer que une représentation exacte des échantillons est faite, assurez-vous d'évaluer la zone de la chambre entière pour chaque échantillon.
- Enregistrer les données d'imagerie par un champ représentatif pour chaque échantillon. Quand l'imagerie de fluorescence Alexa Fluor 488, utilisez le même temps d'exposition pour tous les échantillons. L'utilisation d'un temps d'exposition cohérente permettra une comparaison plus précise des résultats avec des antigènes de test par rapport aux témoins.
4. Les résultats représentatifs:
Exemples de résultats avec des cellules de surface IFA Leptospira interrogans utilisant des anticorps contre la surface et de sub-surface des protéines sont présentées dans la figure 2. Un test est considéré positif lorsque la fluorescence importante est détectée dans les échantillons avec des leptospires intact pour une protéine d'intérêt qui est la surface exposée (figure 2A). Habituellement, lors d'un test positif (ici, la surface exposée OmpL54), environ la même intensité de fluorescence est observée dans des cellules intactes et deux perméabilisées (figure 2A) Il est essentiel d'inclure un contrôle négatif pour l'intégrité des membranes externe utilisant des anticorps contre un sous-sol , de préférence périplasmique des protéines (par exemple leptospires FlaA1, fig. 2B). Ce n'est que lorsque les données montrent que la membrane externe est restée intacte During de l'expérience, à savoir des anticorps contre une protéine de sub-surface ne réagissent pas à des cellules intactes (pas de fluorescence ou fluorescence beaucoup plus faible lorsque comparé à l'échantillon perméabilisées comme dans la Fig. 2B), peut-on conclure que la protéine (s) d'intérêt est surface exposée. L'inclusion d'expériences avec des sérums pré-immuns (dans le cas d'anticorps polyclonaux) comme un contrôle négatif supplémentaire est indispensable pour les données non ambiguë et ne doit pas céder à fluorescence substantiels dans des cellules intactes ou perméabilisées (Fig. 2A, 2C). Tache DAPI est nécessaire pour visualiser les leptospires lorsque les résultats négatifs (pas de fluorescence Alexa Fluor 488) sont observés. Contre-coloration à l'iodure de propidium est une alternative acceptable à DAPI.
Cette méthode est qualitative plutôt que quantitative que brillante fluorescence peut être dû à la surface exposée de multiples épitopes antigéniques être reconnue dans un seul antigène par rapport à d'autres antigènes de l'abondance égale, mais avec moins d'épitopes de surface exposée. Par conséquent, les intensités de fluorescence ne peut être utilisé pour comparer la réactivité des anticorps mêmes, telles que des cellules intactes par rapport perméabilisées et des intensités de fluorescence entre pas de protéines différentes. Cette distinction est importante quand un résultat ambigu, où la fluorescence est obtenue significativement moins est observé dans des cellules intactes que dans les cellules perméabilisées (figure 2C). Un tel résultat indique soit que la protéine est dans un endroit du sous-sol (avec une certaine coloration de fond non spécifique des cellules intactes), les anticorps sont obligatoires préférentiellement aux non-autochtones épitopes qui sont exposés après perméabilisation méthanol ou d'une protéine peut avoir plusieurs sites de localisation comme décrit pour les protéines Erp et Elp d'un autre spirochète, Borrelia burgdorferi 14. Dans les deux cas, un résultat ambigu IFA comme celui-ci nécessite des approches alternatives telles que la biotinylation de surface ou la protéolyse de surface pour déterminer si la protéine d'intérêt est exposées à la surface ou non 10.
Organigramme Figure 1. Pour la surface de dosage immuno-fluorescence des spirochètes Leptospira interrogans. Tout d'abord, 1 ml de suspension cellulaire sont ajoutés à chaque puits de diapositives chambre de deux puits (au moins deux lames pour chaque expérience) et incubées pendant les leptospires se conformer. Ensuite, les leptospires sont fixés sur des lames de chambre en ajoutant 1 ml / puits de 2% de paraformaldéhyde (PFA) pour les échantillons avec la membrane externe intacte (OM) et 1 ml / puits de 100% de méthanol à froid pour les échantillons avec perméabilisées OM. Ensuite, les leptospires sont incubées avec des anticorps reconnaissant exposées à la surface des protéines avec des anticorps de contrôle pour les protéines de subsurface (primaire Ab) à 30 ° C pendant 90 min. Ensuite, les anticorps primaires sont détectés par incubation avec 1 ml / puits d'Alexa Fluor 488 anticorps secondaires conjugués. Enfin, les cellules sont visualisées par microscopie à fluorescence.
Analyse de surface Figure 2. Immunofluorescence de protéines de leptospires. Leptospira interrogans spirochètes ont été sondés avec des immunsérums et de pré-immun, et les résultats négatifs ont été jumelés avec une contre-coloration DAPI pour démontrer la présence de spirochètes. Un filtre à fluorescence verte a été utilisée pour détecter Alexa Fluor 488 anticorps secondaire marqué se liant à la surface des protéines exposées et bleu / cyan filtre pour détecter la fluorescence se liant à l'ADN des cellules DAPI. A) Les leptospires sondés avec des anticorps reconnaissant une protéine de surface exposée, OmpL54 10. B) les cellules sondés avec des anticorps contre une protéine périplasmique de subsurface, FlaA1 (contrôle négatif). C) Les cellules sondés avec des anticorps contre la leptospirose porine, OmpL1. La liaison du sérum de lapin aux leptospires ont été détectés avec Alexa Fluor 488 fragments conjugués IgG de chèvre anti-lapin. Toutes les images sont prises après 4 sec longue exposition.
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Discussion
Notre surface IFA technique est similaire à celui utilisé pour démontrer l'exposition de surface de différentes borrelial 15, 16 et 12 de leptospires, 17 protéines. Les détails de la méthode de la surface IFA décrits ici sont conçus pour minimiser la manipulation de cellules dans un effort pour maintenir l'intégrité de la membrane externe, tout en profitant de la tendance des cellules Leptospira d'adhérer à des lames de verre. La méthode consiste à une concentration plus faible (2% contre 4%) de paraformaldéhyde, le lavage avec le tampon de la membrane externe de stabilisation (PBS 5 mM MgCl 2) et moins d'étapes de lavage que précédemment publié protocoles 12, 17. En outre, notre méthode de la surface IFA souligne l'importance des contrôles qui sont essentiels pour l'interprétation des données précises. Une limitation de la méthode est qu'elle nécessite la disponibilité d'anticorps spécifiques qui sont capables de reconnaître exposées à la surface épitope (s) de la protéine d'intérêt. Dans certains cas, l'encombrement stérique par des protéines de surface ou des lipopolysaccharides peut empêcher la formation d'anticorps-antigène. Néanmoins, la méthode de la surface IFA est une technique relativement simple pour évaluer directement l'exposition en surface des protéines et peut être utilisé soit comme une approche autonome ou de concert avec d'autres techniques, telles que immunogold étiquetage, la protéolyse de surface, etc
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par Public Health Service subventions AI-34431 (pour DAH) de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et par VA Fonds de recherche médicale (à la DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
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