Summary
Un metodo efficace per valutare l'esposizione superficiale di proteine leptospiral è descritto. Il metodo è specificamente progettato per evitare l'interruzione della membrana esterna delle cellule fragili leptospiral. Questa tecnica richiede l'impiego di diversi controlli negativi per valutare l'integrità della membrana esterna e la specificità della reazione anticorpale.
Abstract
Proteine della superficie batterica sono coinvolti in contatto diretto con le cellule ospiti e l'assorbimento delle sostanze nutritive dall'ambiente 1. Per questo motivo, localizzazione cellulare in grado di fornire intuizioni sul ruolo funzionale delle proteine batteriche. Localizzazione superficiale delle proteine batteriche è un passo fondamentale verso l'identificazione dei fattori di virulenza coinvolti nei meccanismi di patogenicità.
Metodi per frazionamento leptospiral 2-5 membrane può essere selettivo per una certa classe di proteine di membrana esterna (OMP), come lipoproteine vs OMP transmembrana, e quindi portare a errata classificazione. Questo probabilmente è dovuto a differenze strutturali e come essi sono associati alla membrana esterna. Le lipoproteine sono associati alle membrane attraverso una interazione idrofobica tra N-terminale porzione lipidica (tre acidi grassi) e dei fosfolipidi doppio strato lipidico 6, 7. Al contrario, OMP transmembrana sono tipicamente integrate nel doppio strato lipidico da anfipatiche β-fogli disposti in una botte struttura simile 8, 9. Inoltre, la presenza di una proteina nella membrana esterna non garantisce necessariamente che la proteina oi suoi domini sono esposte sulla superficie. Spirochete membrane esterne sono noti per essere i metodi fragile e occorre, pertanto coinvolgono la manipolazione dolce delle cellule e l'inclusione di sub-superficie proteina controlli per valutare l'integrità della membrana esterna.
Qui, presentiamo una immunofluorescenza saggio (IFA) per valutare direttamente l'esposizione di proteine sulla superficie leptospire intatto. Questo metodo si basa sul riconoscimento delle proteine di superficie leptospiral da antigene-anticorpi specifici. Qui, gli anticorpi specifici per OmpL54 10 sono detetcted aftero vincolanti per natale, epitopi superficie esposta. Confronto di reattività anticorpi contro le cellule intatte permeabilizzate consente la valutazione della distribuzione cellulare e se non è selettivo una proteina presente sulla superficie leptospiral. L'integrità della membrana esterna deve essere valutato utilizzando anticorpi ad una o più proteine del sottosuolo, preferibilmente situato nel periplasma.
Il metodo IFA superficie può essere utilizzato per analizzare l'esposizione superficie di qualsiasi proteina leptospiral a cui gli anticorpi specifici sono disponibili. Sia l'utilità e la limitazione del metodo dipende dal fatto che gli anticorpi utilizzati sono in grado di legarsi agli epitopi nativi. Dal momento che gli anticorpi sono spesso sollevate contro proteine ricombinanti, di epitopi nativi, superficie esposta proteine potrebbe non essere riconosciuto. Tuttavia, il metodo superficie IFA è uno strumento prezioso per lo studio delle componenti intatte superfici batterica. Questo metodo può essere applicato non solo per leptospire, ma anche spirochete e altri batteri gram-negativi. Per i più forti conclusioni sulla superficie-esposizione di OMP, un approccio globale che coinvolga diversi metodi di localizzazione delle cellule si consiglia 10.
Protocol
1. Fissazione di Leptospira di vetrini
- Leptospira interrogans è una classe BSL2 patogeno. Lavorando con cellule vive che richiede una gestione appropriata, ad esempio i guanti, camice e fasi di pipettamento in una sterile-cappuccio.
- Crescere Leptospira in EMJH medium11, integrato con siero di coniglio 1% a 30 ° C fino a raggiungere metà e la fine-log fase (densità di 5 x 10 7 a 5 x 10 8 cellule / ml) per circa 6 giorni.
- Raccolta della cultura per centrifugazione a ~ 2000 xg per 7 minuti a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere delicatamente il pellet in tampone fosfato (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 ad una concentrazione finale di 5 x 10 8 cellule / ml.
- Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di diapositive da camera a due ben vetro e incubare a 30 ° C per 80 min per consentire alle cellule di aderire.
- Rimuovere con attenzione il liquido contenente cellule non legato per aspirazione.
- Fissare i batteri rimasti intatti alle diapositive di vetro con l'aggiunta di 1 ml / pozzetto del 2% paraformaldeide in PBS-5 mM MgCl 2. Incubare per 40 min a 30 ° C. Questi diapositive saranno per la valutazione della superficie esposta proteine.
- Vetrini di controllo per valutare sotto la superficie delle proteine, la membrana esterna permeabilize fissando con 1 ml / pozzetto del 100% ghiacciata metanolo. Incubare a -20 ° C per 20 min. Metanolo agisce in diversi modi: si permeabilizes la membrana esterna, denaturates le proteine, e le cellule correzioni alle diapositive di vetro.
- Rimuovere gli agenti di fissaggio mediante aspirazione.
2. Etichettatura con anticorpi specifici
- Blocca legame non specifico con l'aggiunta di 1 ml / pozzetto di tampone di bloccaggio (Difco Leptospira arricchimento EMJH). Incubare a 30 ° C per 90 min.
- Diluire l'anticorpo specifico (sieri immuni di coniglio o di anticorpi monoclonali di topo, coniglio qui sieri policlonali specifici per OmpL54 10, FlaA1 12 e OmpL1 13) e pre-immune coniglio ascetico sieri o il mouse fluido che non contengono anticorpi (quando utilizzati come controlli negativi) in tampone di bloccaggio. Diluizioni per ogni anticorpo devono essere determinati empiricamente a seconda del titolo anticorpale, antigene-anticorpo reattività e l'abbondanza di proteine all'interno della cellula. La gamma usuale è 1:50 a 1:600.
- Rimuovere il tampone di bloccaggio tramite aspirazione e aggiungere 1 ml / pozzetto di diluire gli anticorpi primari.
- Incubare a 30 ° C per 1 ora.
- Asportare il liquido mediante aspirazione e lavare i pozzetti tre volte con PBS (1 ml / pozzetto).
3. Visualizzazione delle leptospire
- Aggiungere 1 ml / pozzetto di Alexa Fluor 488-etichettati anticorpi secondari (o anti-rabbit IgG di capra o di capra anti-topo IgG) diluito 1:2000 e fluorescenti acido nucleico macchia, 4'6-diamidino-2-fenil-indolo dicloridrato ( DAPI) diluito ad una concentrazione finale di 0,25 mg / ml in tampone di bloccaggio. Questo passaggio garantisce il rilevamento di legame degli anticorpi e la presenza di tutte le spirochete indipendente di legame degli anticorpi, rispettivamente.
- Incubare i vetrini a 30 ° C per 45 min.
- Asportare il liquido mediante aspirazione e lavare i pozzi due volte con PBS e una volta con acqua distillata (1 ml / pozzetto).
- Rimuovere le camere e la striscia adesiva da vetrini e asciugare all'aria per circa 10 min.
- Aggiungi prolungare oro anti-sbiadimento mezzo di montaggio (2 x 20 l per vetrino) e una x 24 50 vetrino mm.
- Incubare per una notte a temperatura ambiente al buio. Questo passaggio è necessario per permettere al mezzo di montaggio per la cura (indurimento).
- Sigillare il coprioggetto con smalto.
- Visualizza la colorazione al microscopio a fluorescenza utilizzando un grigio-azzurro / blu rilevamento filtro DAPI e un filtro di rilevamento verde per Alexa Fluor 488. Per garantire che una rappresentazione accurata dei campioni è fatto, assicuratevi di valutare l'intera area della camera per ogni campione.
- Registrare i dati da immagini di un campo rappresentante per ogni campione. Quando l'imaging Alexa Fluor 488 fluorescenza, utilizzare lo stesso tempo di esposizione per tutti i campioni. Usando un tempo coerente esposizione da consentire il confronto più accurato dei risultati con gli antigeni di test rispetto ai controlli.
4. Rappresentante dei risultati:
Esempi di risultati superficie IFA con le cellule Leptospira interrogans utilizzando anticorpi contro la superficie e sub-superficiali proteine sono mostrati nella Figura 2. Un test è considerato positivo quando fluorescenza sostanziale viene rilevato in campioni con leptospire intatto per una proteina di interesse che è superficie esposta (fig. 2A). Di solito, in un test positivo (qui, superficie esposta OmpL54), circa lo stesso intensità di fluorescenza si osserva nelle cellule sia integro e permeabilizzate (Fig. 2A) È essenziale includere un controllo negativo per l'integrità della membrana esterna, utilizzando anticorpi contro un sottosuolo , preferibilmente periplasmatico proteine (ad esempio leptospiral FlaA1, fig. 2B). Solo quando i dati mostrano che la membrana esterna è rimasta intatta during dell'esperimento, cioè di anticorpi contro un sub-superficiale di proteine non reagiscono alle cellule intatte (non fluorescenza o fluorescenza molto più debole rispetto al campione permeabilizzate come in fig. 2B), si può concludere che la proteina (s) di interesse superficie esposta. L'inclusione degli esperimenti con pre-sieri immuni (nel caso degli anticorpi policlonali) come un ulteriore controllo negativo è essenziale per dati univoci e non deve cedere a fluorescenza sostanziale cellule intatte o permeabilizzate (Fig. 2A, 2C). Macchia DAPI è necessario per visualizzare leptospire quando i risultati negativi (nessun Alexa Fluor 488 fluorescenza) siano rispettate. Controcolorazione con ioduro di propidio è un'alternativa accettabile per DAPI.
Questo metodo è qualitativa piuttosto che quantitativa come brillante fluorescenza può essere dovuto alla superficie più esposta epitopi antigenici essere riconosciuto in un singolo antigene rispetto a altri antigeni di abbondanza uguali ma con un minor numero di epitopi di superficie esposta. Pertanto le intensità di fluorescenza può essere utilizzato solo per confrontare la reattività degli anticorpi stessi, come le cellule intatte contro permeabilizzate e intensità di fluorescenza non tra proteine diverse. Questa distinzione è importante quando un risultato ambiguo, dove si ottiene molto meno fluorescenza si osserva nelle cellule intatte che in cellule permeabilizzate (Fig. 2C). Tale risultato indica che la proteina è in una posizione sotto la superficie (con alcune non specifica colorazione di fondo delle cellule intatte), gli anticorpi sono vincolanti preferenzialmente a non nativi epitopi che sono esposti dopo permeabilizzazione metanolo o di una proteina potrebbe avere più siti di localizzazione, come descritto per le proteine Erp e Elp di un altro spirocheta, Borrelia burgdorferi 14. In entrambi i casi, un risultato ambiguo IFA come questo richiede approcci alternativi come biotinilazione superficie o proteolisi superficie per determinare se la proteina di interesse superficie esposta o meno 10.
Figura 1. Diagramma di flusso per la superficie di immuno-fluorescenza saggio di Leptospira interrogans spirochete. In primo luogo, 1 ml di sospensione cellulare viene aggiunto in ciascun pozzetto della due-e diapositive da camera (almeno due vetrini per ogni esperimento) e incubate per leptospire di aderire. Successivamente, leptospire sono fissati alle diapositive da camera con l'aggiunta di 1 ml / pozzetto del 2% paraformaldeide (PFA) per i campioni con intatto membrana esterna (OM) e 1 ml / pozzetto del 100% metanolo freddo per i campioni con permeabilizzate OM. Successivamente, leptospire vengono incubati con gli anticorpi riconoscimento superficie esposta proteine con anticorpi di controllo per le proteine del sottosuolo (Primario Ab) a 30 ° C per 90 min. Poi, gli anticorpi primari sono rilevati mediante incubazione con 1 ml / pozzetto di Alexa Fluor 488 anticorpi secondari coniugati. Infine, le cellule vengono visualizzati al microscopio a fluorescenza.
Figura 2. Un'analisi superficiale delle proteine leptospiral immunofluorescenza. Leptospira interrogans spirochete sono stati sondati con sieri immuni e pre-immune, ed i risultati negativi sono stati accoppiati con un contrasto DAPI per dimostrare la presenza di spirochete. Una fluorescenza verde filtro è stato usato per rilevare Alexa Fluor 488 anticorpo marcato secondaria legame con le proteine di superficie esposta e blu / grigio-azzurro fluorescenza filtro per rilevare legame al DNA delle cellule DAPI. A) leptospire sondato con anticorpi riconoscere una proteina di superficie esposta, OmpL54 10. B) Le cellule sondato con anticorpi contro una proteina periplasmatico sottosuolo, FlaA1 (controllo negativo). C) Le cellule sondato con anticorpi contro leptospiral porina, OmpL1. Vincolante di sieri di coniglio leptospire sono stati rilevati con Alexa Fluor 488 coniugato capra anti-coniglio frammenti di IgG. Tutte le immagini sono prese dopo 4 secondi di esposizione a lungo.
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Discussion
La nostra tecnica IFA superficie è simile a quello utilizzato per dimostrare l'esposizione superficie di vari borrelial 15, 16 e leptospiral 12, 17 proteine. I dettagli del metodo superficie IFA qui descritti sono stati progettati per ridurre al minimo la manipolazione di cellule, nel tentativo di mantenere l'integrità della membrana esterna sfruttando la tendenza delle cellule Leptospira di aderire alle diapositive di vetro. Il metodo prevede una concentrazione più bassa (2% versus 4%) di paraformaldeide, lavaggio esterno con membrana tampone stabilizzante (PBS 5 mM MgCl 2) e un minor numero di fasi di lavaggio di quanto precedentemente pubblicato protocolli 12, 17. Inoltre, il nostro metodo superficie IFA sottolinea l'importanza dei controlli che sono essenziali per una precisa interpretazione dei dati. Un limite del metodo è che richiede la disponibilità di anticorpi specifici che sono in grado di riconoscere superficie esposta epitopo (s) della proteina di interesse. In alcuni casi, sterico da proteine di superficie o di altri lipopolisaccaridi può impedire antigene-anticorpo formazione. Tuttavia, il metodo superficie IFA è una tecnica relativamente semplice per valutare direttamente l'esposizione superficiale di proteine e può essere utilizzato sia come stand alone approccio o di concerto con altre tecniche, come ad esempio immunogold etichettatura, la proteolisi di superficie, ecc
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Public Health Service concedere AI-34431 (a DAH) dell'Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive e da Fondi VA Medical Research (a DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
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