Summary
レプトスピラタンパク質の表面露出を評価するために効率的な方法が記載されている。方法は、特にレプトスピラ細胞の脆弱な外膜の崩壊を回避するために設計されています。この手法にはいくつかのネガティブコントロールの雇用は、外膜と抗体反応の特異性の整合性を評価する必要があります。
Abstract
細菌の表面タンパク質は、宿主細胞と直接接触し、環境1からの栄養素の摂取に関与している。このような理由から、細胞内局在は、細菌タンパク質の機能的役割についての洞察を提供することができます。細菌タンパク質の表面の局在は、病原性のメカニズムに関与病原因子の同定に向けた重要なステップです。
レプトスピラ膜2-5を分画するための方法はそのようなリポタンパク質対貫通OMPSとして外膜タンパク質（OMPS）、特定のクラスに対して選択的であるため、誤分類する可能性があります。この可能性は、構造的な違いと、それらがどのように外膜に関連付けられているためです。リポタンパク質はN末端 脂質部分（3つの脂肪酸）と脂質二重層のリン脂質6,7の間に疎水性相互作用を介して膜に関連付けられています。対照的に、膜貫通OMPSは通常、樽状の構造8,9に配置されたβ-シートの両親媒性で脂質二重層に組み込まれています。さらに、外膜のタンパク質の存在は、必ずしも蛋白質またはそのドメインが表面に露出していることを保証するものではありません。スピロヘータ外側の膜は壊れやすくなるため、サブ表面のタンパク質の細胞とインクルージョンの穏やかな操作を含む方法を必要とすることが知られている外膜の完全性を評価するために制御します。
ここで、我々が直接そのままレプトスピラ上のタンパク質の表面の露出を評価するために蛍光抗体法（IFA）法を提案する。この方法は、抗原特異的抗体によるレプトスピラ表面タンパク質の認識に基づいています。ここで、OmpL54 10の特異的な抗体は、ネイティブ、表面露出エピトープにaftero結合detetctedされています。無傷対透過性細胞への抗体の反応性の比較は、細胞分布の評価を可能にし、蛋白質は、レプトスピラ表面上に選択的に存在するかどうか。外膜の完全性、好ましくは、ペリプラズムに位置する1つまたは複数の地下タンパク質、抗体を用いて評価すべきである。
表面IFA法は、特異的抗体が利用可能な任意のレプトスピラタンパク質の表面の露出を分析するために使用することができます。法の有用性と限界の両方が採用さ抗体がネイティブエピトープに結合することができるかどうかによって異なります。抗体はしばしば組換えタンパク質、天然のエピトープに対して提起されているので、表面に露出したタンパク質が認識されない場合があります。それにもかかわらず、表面IFA法は無傷細菌の表面の成分を研究するための貴重なツールです。この方法は、レプトスピラだけでなく、他のスピロヘータとグラム陰性菌に対してだけでなく、適用することができます。 OMPSの表面露出に関する強力な結論のために、いくつかの細胞の局在の方法を含む包括的なアプローチは、10をお勧めします。
Protocol
1。スライドガラスへのレプトスピラの固定
- レプトスピラinterrogansはクラスBSL2病原体です。生細胞での作業には、手袋、実験室、コートと無菌フードのピペッティング操作などの適切な取り扱いが必要です。
- 30 ° Cに到達するまで半ばまで約6日間の後期対数増殖期（5 × 10 8細胞/ mlに5 × 10 7の密度）。で、1％ウサギ血清を補充した、EMJH medium11でレプトスピラを拡大
- 室温で7分間〜2000 × gで遠心分離によって培養を回収する。
- 吸引により上清を除去し、穏やかにリン酸塩でペレットを再懸濁さは5 × 10 8細胞/ mlの最終濃度にのMgCl 2、pH7.2生理食塩水（PBS）-5 mMのバッファ付き。
- 二ウェルチャンバースライドガラスの各ウェルに細胞懸濁液1 mlを加え、30℃でインキュベート℃を80分間、細胞が付着できるようにする。
- 慎重に吸引して未結合の細胞を含む液体を取り除く。
- PBS - 5 mMのMgCl 2の2％パラホルムアルデヒドを1ml /ウェルを添加することによりガラススライドに、残りの無傷の細菌を修正。 30℃で40分間インキュベート℃にこれらのスライドは、表面に露出したタンパク質の評価になります。
- サブ表面タンパク質を評価するコントロールのスライドの場合は、/、100％の氷冷メタノール1mlで固定することにより外膜を透過性。 20分間-20℃でインキュベートする。メタノールは、いくつかの方法で機能する：それは、外膜をpermeabilizes、タンパク質をdenaturates、およびガラススライドに細胞を修正しています。
- 吸引してエージェントを修正削除する。
2。特異的抗体で標識
- /ウェルのブロッキングバッファー（Difco社レプトスピラ濃縮EMJH）1 mlを添加することにより、非特異的結合をブロックする。 90分間30℃でインキュベートする。
- 特異抗体（ここで免疫ウサギの血清またはマウスモノクローナル抗体、ポリクローナルウサギOmpL54 10の特定の血清、FlaA1 12、およびOmpL1 13）と、抗体を含まない免疫前ウサギ血清やマウスの禁欲的な液を希釈する（ネガティブコントロールとして利用するとき）にバッファをブロック。各抗体の希釈は、細胞中の抗体価、抗原抗体反応やタンパク質の豊富に応じて経験的に決定する必要があります。通常の範囲は、1:50〜1:600である。
- 吸引でブロッキングバッファーを取り除き、希釈した一次抗体を1 ml /ウェルを追加。
- 1時間、30℃でインキュベートする。
- 吸引して溶液を取り除き、PBS（1ミリリットル/ウェル）を各ウエル3回洗浄する。
3。レプトスピラの可視化
- を1ml /ウェルのアレクサ希釈® 488標識二次抗体（ヤギ抗ウサギIgGまたはヤギ抗マウスIgGのいずれか）1:2000と蛍光核酸染色、4'6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール二塩酸塩を（追加するDAPIは）をブロッキングバッファーで0.25μg/ mlの最終濃度に希釈した。このステップでは、それぞれ、抗体の検出結合と抗体の結合に関係なく、すべてのスピロヘータの存在を保証する。
- ° C 45分間30℃のスライドをインキュベートする。
- 吸引によって液体を除去し、蒸留水（1ml /ウェル）で一度PBSで2回ウェルを洗浄して。
- チャンバーとスライドガラスと約10分間空気乾燥から粘着ストリップを外します。
- ゴールド耐フェードマウンティング培地（スライドあたり2 × 20μl）を、24 × 50 mmのカバースリップを褪色追加。
- 暗所で室温で一晩インキュベートする。このステップでは、治すためにマウンティング培地（硬化）するために必要です。
- マニキュアでカバーガラスをシール。
- DAPI用シアン/青検出フィルタとAlexa Fluor 488のための緑の検出フィルタを用いて蛍光顕微鏡による染色を視覚化する。サンプルの正確な表現がなされていることを確認するには、各サンプル全体チャンバーの面積を評価することを確認してください。
- イメージング各サンプルの代表的なフィールドでデータを記録します。イメージングのAlexa Fluor 488の蛍光が、すべてのサンプルに対して同一の露光時間を使用する場合。一貫性のある露光時間を使用すると、テストの抗原に対するコントロールと結果のより正確な比較ができるようになります。
4。代表的な結果：
表面および表面蛋白質に対する抗体を用いたレプトスピラinterrogans細胞表面IFA結果の例を図2に示されています。実質的な蛍光が、表面（図2A）公開されている目的の蛋白質のために無傷レプトスピラのサンプルで検出されると、テストは陽性とみなされます。通常、正のテスト（ここで、OmpL54表面露出）で、ほぼ同じ蛍光強度はそのまま、膜透過した細胞（図2A）の両方で観察されるそれは、地下に対する抗体を用いて外膜の完全性のためのネガティブコントロールを含めることが不可欠です。 、好ましくはペリプラズムタンパク質（例えばレプトスピラFlaA1、図2B）。データは外膜が無傷の杜日残っていることを示しているときにのみngの実験で、サブ表面蛋白質に対するすなわち抗体は、インタクトな細胞（図2のように透過処理したサンプルと比較した場合、蛍光または非常に弱い蛍光がない。2B）に反応しない、それは目的のタンパク質（s）があると結論することができます表面が露出。追加の陰性対照として免疫前血清（ポリクローナル抗体の場合）を用いた実験を含めることは、明確なデータが不可欠であり、無傷または膜透過した細胞（図2A、2C）に実質的な蛍光が得られないはず。染色DAPIは陰性の結果が（ないのAlexa Fluor ® 488蛍光）が観察されているときにレプトスピラを可視化する必要があります。ヨウ化プロピジウムで対比すると、DAPIに受け入れ可能な代案です。
明るい蛍光が等しい豊富の他の抗原に対する相対的な単一の抗原ではなく、より少ない表面露出エピトープと認識されている複数の表面露出抗原エピトープが原因である可能性があるため、このメソッドは、定性的ではなく定量的である。したがって、蛍光強度は、そのような別のタンパク質間の無傷対透過性細胞と蛍光ではない強度と同じ抗体の反応性を比較するために使用することができます。この区別は大幅に少ない蛍光を透過性細胞（図2C）に比べて無傷の細胞で観察されている場所、あいまいな結果が得られた場合に重要です。そのような結果はどちらのタンパク質は、（完全な細胞のいくつかの非特異的なバックグラウンド染色を持つ）サブ表面の場所にあることを示し、抗体は複数の可能性のある優先的にメタノールの透過性やタンパク質の後に公開されている非ネイティブエピトープへの結合です。局在部位は、別のスピロヘータ、 ボレリアブルグドルフェリ 14のERPとELPタンパク質について説明した。どちらの場合でも、このようなあいまいなIFAの結果は、目的のタンパク質を10表面に露出されているかどうかを判断するためにそのような表面ビオチン化または表面のタンパク質分解のよ うな代替的なアプローチが必要です。
レプトスピラinterrogansスピロヘータの表面免疫蛍光アッセイのための図1。フローチャート。最初に、細胞懸濁液の1mlは、2つのウェルチャンバースライドの各ウェルに添加し（各実験のための少なくとも二つのスライド）と付着するレプトスピラインキュベートする。次に、レプトスピラはそのまま外膜（OM）と透過性OMの試料1ミリリットル/よく100％冷メタノールを持つサンプルを/ウェルの2％パラホルムアルデヒド（PFA）の1mlを添加することによりチャンバースライドに固定されています。次に、レプトスピラは、30の地下タンパク質（一次抗体の）のためのコントロール抗体で90分間Cと一緒に表面に露出したタンパク質を認識する抗体とインキュベートされています。その後、一次抗体/ウェルのAlexa Fluor ® 488標識二次抗体を1mlとのインキュベーションによって検出されます。最後に、細胞は蛍光顕微鏡により可視化。
レプトスピラタンパク質の図2。表面免疫蛍光分析。レプトスピラinterrogansスピロヘータは免疫と免疫前血清でプローブした、と否定的な結果は、スピロヘータの存在を実証するためにDAPI対比染色と対になっていた。緑色蛍光フィルターは、細胞のDNAへのDAPIが結合を検出するために露出タンパク質と青/シアン蛍光フィルターを表面に結合のAlexa Fluor ® 488標識二次抗体を検出するために使用されていました。 A）レプトスピラは、表面露出タンパク質、OmpL54 10を認識する抗体でプローブ。 B）細胞は、細胞周辺地下タンパク質、FlaA1（ネガティブコントロール）に対する抗体でプローブ。 C）細胞は、レプトスピラポーリン、OmpL1に対する抗体でプローブ。レプトスピラのウサギの血清の結合は、のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG抗体の断片を検出した。すべての画像は4秒長時間露光後に撮影されています。
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Discussion
私達の表面IFA技術は、様々なborrelial 15、16、レプトスピラ12、17のタンパク質の表面の露出を示すために使用されているものと似ています。ここで説明する表面IFAの方法の詳細は、スライドガラスに付着しレプトスピラ細胞の傾向を利用しながら外膜の完全性を維持する目的で、細胞の操作を最小限に抑えるように設計されています。方法は、外膜安定化バッファー（PBS 5 mMのMgCl 2）、すでに公開されているプロトコル12、17より少ない洗浄ステップで洗浄、パラホルムアルデヒドの低濃度（4％対2％）が含まれます。さらに、私達の表面IFA法は、正確なデータの解釈に不可欠な、コントロールの重要性を強調している。方法の制限は、目的のタンパク質の表面に露出したエピトープを認識することが可能な特異的抗体の可用性を必要とすることである。場合によっては、他の表面タンパク質またはリポ多糖による立体障害は、抗体 - 抗原の形成を防ぐことができます。それにもかかわらず、表面IFA法は、直接タンパク質の表面の露出を評価するための比較的簡単なテクニックで、スタンドアロンのアプローチとして、またはそのような免疫金標識、表面のタンパク質分解など他の技術、とのコンサートでも使用できます
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、公衆衛生サービス助成金AI - 34431（DAHに）アレルギーと国立感染症研究所からとVA医学研究基金（DAHに）によっても支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M.
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A.
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A.
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
