Summary
Эффективным методом для оценки поверхностной воздействия лептоспирозный белков описывается. Метод разработан специально, чтобы избежать разрушения хрупкой внешней мембраны лептоспирозный клеток. Этот метод требует применения нескольких отрицательных контролей для оценки целостности наружной мембраны и специфичность реакции антител.
Protocol
1. Фиксация лептоспир в стеклах
- Лептоспир interrogans класс BSL2 возбудителя. Работа с живыми клетками требует надлежащего обращения, например, в перчатках, лабораторный халат и пипетки шаги в стерильных капотом.
- Расти лептоспир в EMJH medium11, с добавлением 1% сыворотки кролика при 30 ° С до достижения ими середине-конце логарифмической фазы (плотность 5 х 10 7 до 5 × 10 8 кл / мл) в течение примерно 6 дней.
- Урожай культуры центрифугированием при ~ 2000 мкг в течение 7 минут при комнатной температуре.
- Удалить супернатант аспирацией и осторожно ресуспендируют осадок в фосфатным буферным раствором (PBS) -5 мМ MgCl 2, pH7.2 в конечной концентрации 5 х 10 8 клеток / мл.
- Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку двух-и слайды камере стекла и инкубировать при температуре 30 ° С в течение 80 минут, чтобы клетки придерживаться.
- Осторожно удалите жидкость, содержащая несвязанные клеток аспирации.
- Fix оставшихся нетронутыми бактерии стеклах добавлением 1 мл / лунку 2% параформальдегида в ФСБ-5 мМ MgCl 2. Инкубируйте в течение 40 мин при температуре 30 ° C. Эти слайды будут для оценки качества поверхностных белков, подвергшихся воздействию.
- Для управления слайдами оценки суб-поверхностных белков, permeabilize наружной мембраны путем установления с 1 мл / лунку 100% ледяной метанола. Инкубировать при температуре -20 ° С в течение 20 мин. Метанол действует в нескольких направлениях: это permeabilizes наружной мембраны, denaturates белков, а также исправления клетки стеклах.
- Удалить фиксации агентов аспирации.
2. Маркировка со специфическими антителами
- Блок неспецифическое связывание добавлением 1 мл / лунку блокирующего буфера (Difco лептоспир обогащению EMJH). Инкубировать при 30 ° С в течение 90 мин.
- Развести специфические антитела (иммунные сыворотки кролика или мыши моноклональных антител, вот кролик поликлональных сывороток, специфичных для OmpL54 10, FlaA1 12 и OmpL1 13) и пре-иммунной сыворотки кролика или мыши аскетической жидкости, не содержащей антитела (если они используются в качестве отрицательного контроля) в блокирующем буфере. Растворы для каждого антитела, должны быть определены эмпирически в зависимости от титра антител, антиген-антитело, реакционная способность и обилие белка в клетке. Обычном диапазоне от 1:50 до 1:600.
- Удалите блокирующий буфер стремлением и добавьте 1 мл / лунку разбавленного первичных антител.
- Инкубировать при температуре 30 ° С в течение 1ч.
- Удалить жидкость стремлением и мыть скважин в три раза с PBS (1 мл / лунку).
3. Визуализация leptospires
- Добавить 1 мл / лунку Alexa Fluor 488-меченых вторичных антител (или козьего анти-IgG кролика или антимышиного IgG) разбавляют 1:2000 и флуоресцентные нуклеиновой кислоты, пятно, 4'6-diamidino-2-фенил-индол дигидрохлорид ( DAPI) разбавляют до конечной концентрации 0,25 мкг / мл в блокирующем буфере. Этот шаг гарантирует обнаружение антител и обязательным наличием всех спирохет независимого связывания антител, соответственно.
- Инкубируйте слайды при температуре 30 ° С в течение 45 мин.
- Удалить жидкость стремлением и мыть скважин в два раза с PBS и один раз дистиллированной водой (1 мл / лунку).
- Удалить камер и клейкой полосой от стекол и воздушно-сухой в течение ~ 10 мин.
- Добавить Продли золото анти-Fade монтажа среде (2 х 20 мкл на слайд) и 24 х 50 мм покровным стеклом.
- Инкубируйте ночь при комнатной температуре в темноте. Этот шаг необходим, чтобы позволить монтажа средних лечения (затвердевают).
- Печать покровным стеклом с лаком для ногтей.
- Визуализируйте окрашивания флуоресцентной микроскопии с использованием голубой / синий фильтр для обнаружения DAPI и зеленый фильтр для обнаружения Alexa Fluor 488. Чтобы убедиться, что точное представление образцов осуществляется, убедитесь, что вы оцениваете всю площадь камеры для каждого образца.
- Запись данных изображения представитель поля для каждого образца. При визуализации Alexa Fluor 488 флуоресценции, используйте то же время экспозиции для всех образцов. Использование последовательного время экспозиции позволит более точное сравнение результатов с тестовыми антигенов сравнению с контрольной группой.
4. Представитель Результаты:
Примеры поверхности IFA результаты с лептоспир клетки interrogans с использованием антител против поверхностных и подповерхностных белков показано на рисунке 2. Тест считается положительным, когда существенные флуоресценции обнаружена в образцах с неповрежденными leptospires для белок, который подвергается поверхность (рис. 2). Как правило, в положительный тест (здесь поверхность, подвергшихся воздействию OmpL54), примерно такой же интенсивности флуоресценции наблюдается и в целости и проницаемыми клеток (рис. 2) Очень важно, чтобы включить отрицательного контроля за внешней мембраны целостности с помощью антител против подземных , предпочтительно периплазматического белка (например лептоспирозный FlaA1, рис. 2B). Только тогда, когда данные показывают, что наружная мембрана остается нетронутым Дуринг эксперимент, то есть антитела к суб-поверхностного белка не реагируют на неповрежденные клетки (без флуоресценции или гораздо слабее флуоресценции по сравнению с проницаемыми образца как на рис. 2B), можно ли сделать вывод, что белок (ы) интересов Поверхность подвергается. Включение эксперименты с предварительно иммунных сывороток (в случае поликлональных антител) в качестве дополнительного отрицательного контроля имеет важное значение для однозначного данных и не должно привести к значительным флуоресценции в нетронутыми или проницаемыми клеток (рис. 2, 2С). DAPI пятна необходимо визуализировать leptospires, когда отрицательный результат (отсутствие Alexa Fluor 488 флуоресценции) не наблюдается. Counterstaining с йодистым пропидий является приемлемой альтернативой DAPI.
Этот метод является качественный, нежели количественный, как ярче флуоресценции может быть связано с несколькими поверхность подвергается антигенных эпитопов, признанных в одном антигена по сравнению с другими антигенами равных изобилии, но с меньшим количеством поверхность подвергается эпитопов. Поэтому интенсивности флуоресценции может быть использован для сравнения реакционной способности же антитела, например, по сравнению с проницаемыми нетронутыми клетки, а не интенсивности флуоресценции между различными белками. Это различие важно, когда неоднозначный результат получается значительно меньше, где наблюдается флуоресценция в неповрежденных клетках, чем в проницаемыми клеток (рис. 2). Такой результат свидетельствует о том, что либо белок находится в подземных место (с некоторым неспецифическим фоне окрашивание интактных клеток), антитела являются обязательными преимущественно для неместных эпитопов, которые подвергаются воздействию после пермеабилизации метанола или белка может иметь несколько локализация сайтов, как описано для Erp и Elp белков другого спирохеты, Borrelia burgdorferi 14. В любом случае неоднозначная IFA результате, такие как это требует альтернативных подходов, таких как биотинилирование поверхности или поверхности протеолиза определить, является ли белок является поверхность, подвергшихся воздействию или нет 10.
Рисунок 1. Блок-схема для поверхностной иммунофлуоресценции анализа из лептоспир interrogans спирохет. Во-первых, 1 мл клеточной суспензии добавляют в каждую лунку двух-и слайды камеры (по крайней мере два слайда для каждого эксперимента) и инкубировали в течение leptospires придерживаться. Далее, leptospires крепятся к камере слайды, добавляя 1 мл / лунку 2% параформальдегида (PFA) для образцов с неповрежденной внешней мембраны (OM) и 1 мл / лунку 100% холодным метанолом для образцов с проницаемыми ОМ. Далее, leptospires инкубируют с антителами признании поверхности, подвергшихся воздействию белки вместе с контролем антитела для подземных белков (первичной АВ) при 30 ° С в течение 90 мин. Затем первичные антитела обнаруживаются инкубации с 1 мл / лунку Alexa Fluor 488 сопряженных вторичных антител. Наконец, клетки визуализируется флуоресцентной микроскопии.
Рисунок 2. Поверхностный анализ иммунофлюоресценции лептоспирозный белков. Лептоспир interrogans спирохеты были исследованы с иммунной и предварительно иммунной сыворотки, так и отрицательные результаты были в паре с DAPI контрастирующая, чтобы продемонстрировать наличие спирохет. Зеленый флуоресцентный фильтр был использован для обнаружения Alexa Fluor 488 меченых вторичными антителами связывания с поверхностью подвергаются белки и синий / голубой флуоресценции фильтр для выявления DAPI связывания с ДНК клетки. ) Leptospires исследовали с антителами признании поверхность подвергается белка, OmpL54 10. В) клетки исследовали с антителами против периплазматического подземных белка, FlaA1 (отрицательный контроль). C) клетки исследовали с антителами против лептоспирозный порин, OmpL1. Связывание кролика сывороток leptospires были обнаружены с Alexa Fluor 488 сопряженных козьего анти-кролик фрагментов IgG. Все изображения взяты спустя 4 сек длительной экспозиции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша поверхности IFA метод похож на что используется для демонстрации поверхностного воздействия различных borrelial 15, 16 и лептоспирозный 12, 17 белков. Детали метода поверхностных IFA, описанные здесь, чтобы свести к минимуму манипуляции клеток в попытке сохранить целостность внешней мембраны, используя преимущества тенденция клеток лептоспир придерживаться стеклах. Метод включает в себя более низкой концентрации (2% против 4%) параформальдегида, стиральные с внешней мембраны стабилизирующим буфером (PBS +5 мМ MgCl 2) и меньшее количество этапов промывки, чем ранее опубликованные протоколы 12, 17. Кроме того, наша поверхность методом ИФА подчеркивает важность контроля, которые необходимы для точной интерпретации данных. Ограничение метода является то, что он требует наличия специфических антител, которые способны распознавать поверхностные, подвергшихся воздействию эпитопа (ов) белок. В некоторых случаях, стерических препятствий другим белкам поверхности или липополисахаридов может предотвратить антитело-антиген образования. Тем не менее, метод IFA поверхности является относительно простой метод для прямого оценке воздействия поверхностных белков и может быть использован как самостоятельный подход или совместно с другими методами, такими как immunogold маркировки, поверхность протеолиза и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Общественной службы здравоохранения грант АИ-34 431 (на ПРЗ) из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, а также В. А. Медицинский научно-исследовательские фонды (на ПРЗ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M.
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A.
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A.
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
