Summary
En effektiv metod för att bedöma ytaktiva exponering leptospiral proteiner beskrivs. Metoden är särskilt utformade för att undvika störningar av den bräckliga yttre membranet av leptospiral celler. Denna teknik kräver anställning av flera negativa kontroller för att bedöma integriteten av yttre membran och specificitet antikroppsreaktion.
Abstract
Bakteriella ytproteiner är involverade i direkt kontakt med värdceller och upptag av näringsämnen från omgivningen 1. Av denna anledning kan cellulär lokalisering ge insikter i funktionella rollen för bakteriella proteiner. Yta lokalisering av bakteriella proteiner är ett viktigt steg mot identifiering av virulensfaktorer inblandade i mekanismer för patogenitet.
Metoder för fraktionering leptospiral membran 2-05 maj vara selektiv för en viss klass av yttre membranproteiner (OMPs), såsom lipoproteiner vs OMPs transmembrana, och därmed leda till felaktig klassificering. Detta sannolikt beror på strukturella skillnader och hur de är knutna till det yttre membranet. Lipoproteiner är associerade med membran via en hydrofob interaktion mellan de N-terminala lipid fraktion (tre fettsyror) och lipider fosfolipider tvåskiktsmembran 6, 7. Däremot är transmembrana OMPs typiskt integrerat i membranet genom amphipathic β-ark ordnade i ett fat-liknande struktur 8, 9. Dessutom har förekomsten av ett protein i yttre membranet inte nödvändigtvis garanterar att det protein eller dess domäner exponeras på ytan. Spirochetal yttre membran är kända för att vara bräcklig och därför kräver metoder som innebär varsam manipulation av celler och integrering av underjordiska protein kontroller för att bedöma integriteten av yttre membran.
Här presenterar vi ett immunofluorescenstest (IFA) för att direkt bedöma exponeringsyta av proteiner på intakt leptospira. Denna metod är baserad på erkännande av leptospiral ytproteiner av antigen-specifika antikroppar. Häri finns antikroppar specifika för OmpL54 10 detetcted aftero bindning till infödda, yta exponerad epitoper. Jämförelse av antikroppar reaktivitet på intakt kontra permeabilized celler möjliggör utvärdering av cellulära distributionen och om huruvida ett protein selektivt finns på leptospiral yta. Integriteten för yttre membran bör bedömas med hjälp av antikroppar mot en eller flera markytan proteiner, företrädesvis är belägen i periplasm.
Ytan IFA Metoden kan användas för att analysera exponeringsyta någon leptospiral protein vilka specifika antikroppar är tillgängliga. Både nyttan och begränsning av metod beror på om de använda antikroppar kan binda till infödda epitoper. Eftersom antikroppar ofta riktats mot rekombinanta proteiner, epitoper av infödda, yt-exponerade proteiner kan inte identifieras. Ändå är ytan IFA-metoden ett värdefullt verktyg för att studera delar av intakt bakteriella ytor. Denna metod kan tillämpas inte bara för leptospira utan också andra spiroketer och gramnegativa bakterier. För starkare slutsatser om yt-exponering OMPs, är en övergripande strategi som omfattar flera metoder cell lokalisering rekommenderade 10.
Protocol
1. Fixering av Leptospira till glas diabilder
- Leptospira interrogans är en klass BSL2 patogen. Arbeta med levande celler Den kräver lämplig hantering, såsom handskar, lab-päls och pipettera steg i en steril-huva.
- Väx Leptospira i EMJH medium11, kompletterad med 1% kaninserum vid 30 ° C tills de når mitten till slutet-log fas (täthet av 5 x 10 7 till 5 x 10 8 celler / ml) i cirka 6 dagar.
- Harvest kulturen genom centrifugering vid ~ 2000 xgi 7 min i rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten genom aspiration och försiktigt suspendera pelleten i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 till en slutlig koncentration av 5 x 10 8 celler / ml.
- Tillsätt 1 ml cellsuspension i varje brunn på två brunnar diabilder kammare glas och inkubera vid 30 ° C i 80 min så att cellerna följa.
- Ta försiktigt bort den vätska som innehåller obundna celler genom aspiration.
- Fix återstående intakta bakterier på glas bilderna genom att tillsätta 1 ml / brunn av 2% paraformaldehyd i PBS-5 mM MgCl 2. Inkubera 40 minuter vid 30 ° C. Dessa bilder kommer att för bedömning av yta exponerad proteiner.
- För styrning diabilder bedömning underjordiska proteiner, permeabilize det yttre membranet genom att fastställa med 1 ml / brunn av 100% iskall metanol. Inkubera vid -20 ° C i 20 minuter. Metanol fungerar på flera sätt: det permeabilizes det yttre membranet denaturates de proteiner, och fixar celler till objektglas.
- Ta bort fastställande agenter genom aspiration.
2. Märkning med specifika antikroppar
- Blockera icke-specifik bindning genom tillsats av 1 ml / brunn blockerande buffert (Difco Leptospira Anrikning EMJH). Inkubera vid 30 ° C i 90 min.
- Späd den specifika antikroppen (immun kanin serum eller mus monoklonala antikroppar, här polyklonala kanin sera specifika för OmpL54 10, FlaA1 12 och OmpL1 13) och pre-immun kanin serum eller mus asketiska vätska som inte innehåller några antikroppar (när den används som negativa kontroller) i blockerande buffert. Spädningar för varje antikropp måste bestämmas empiriskt beroende på antikroppstiter, antigen-antikropp reaktivitet och överflöd av protein i cellen. Den vanliga serien är 1:50 till 1:600.
- Avlägsna den blockerande buffert genom aspiration och tillsätt 1 ml / brunn utspädd primära antikroppar.
- Inkubera vid 30 ° C i 1h.
- Avlägsna vätskan genom aspiration och tvätta brunnarna tre gånger med PBS (1 ml / brunn).
3. Visualisering av leptospira
- Tillsätt 1 ml / brunn av Alexa Fluor 488-märkta sekundära antikroppar (antingen get-anti-kanin IgG eller get-anti-mus-IgG) utspädd 1:2000 och fluorescerande nukleinsyra fläcken, 4'6-diamidino-2-fenyl-indole dihydroklorid ( DAPI) utspädd till en slutlig koncentration av 0,25 mikrogram / ml i blockerande buffert. Detta steg ger detektion av antikroppar bindande och närvaron av alla spiroketer oberoende av antikroppar bindande, respektive.
- Inkubera objektglasen vid 30 ° C i 45 min.
- Avlägsna vätskan genom aspiration och tvätta brunnarna två gånger med PBS och en gång med destillerat vatten (1 ml / brunn).
- Ta bort kamrarna och klisterremsan från glaset diabilder och lufttorka för ~ 10 min.
- Lägg Förläng Guld anti-fade monteringsmedium (2 x 20 l per bild) och ett 24 x 50 mm täckglas.
- Inkubera över natten vid rumstemperatur i mörker. Detta steg är nödvändigt att låta monteringsmedium att bota (härda).
- Täta täckglas med nagellack.
- Visualisera färgning av fluorescensmikroskopi med en cyan / blå upptäckt filter för DAPI och en grön upptäckt filter för Alexa Fluor 488. För att säkerställa att en korrekt bild av proverna görs, se till att du utvärdera hela kammaren området för varje prov.
- Spela in data genom exponering av ett representativt område för varje prov. När avbildning Alexa Fluor 488 fluorescens, använda samma exponeringstid för alla prover. Med hjälp av en konsekvent exponeringstid kommer att ge mer exakta jämförelser av resultat med test antigener kontra kontroller.
4. Representativa resultat:
Exempel på yta IFA resultat med Leptospira interrogans celler med antikroppar mot ytan och under ytan proteiner visas i figur 2. Ett test betraktas som positivt när betydande fluorescens upptäcks i prover med intakt leptospira för ett protein av intresse som är yta som exponeras (bild 2A). Vanligtvis, i ett positivt test (här, yt-exponerade OmpL54), är ungefär samma fluorescensintensitet observerats i både intakt och permeabilized celler (Fig. 2A) Det är viktigt att inkludera en negativ kontroll av yttre membran integritet med hjälp av antikroppar mot ett under ytan , helst periplasmic protein (t.ex. leptospiral FlaA1, bild. 2B). Först när data visar att det yttre membranet har förblivit intakt During experimentet, dvs antikroppar mot en sub-ytprotein inte reagerar på intakta celler (ingen fluorescens eller mycket svagare fluorescens jämfört med permeabilized provet som i Fig.. 2B), kan man dra slutsatsen att proteinet (s) av intresse yta exponerad. Införande av experiment med pre-immun sera (i fallet med polyklonala antikroppar) som en ytterligare negativ kontroll är nödvändig för entydiga uppgifter och bör inte ge betydande fluorescens i intakt eller permeabilized celler (Fig. 2A, 2C). DAPI fläcken är nödvändigt att visualisera leptospira när negativt resultat (inget Alexa Fluor 488 fluorescens) iakttas. Motfärgning med propidiumjodid är ett godtagbart alternativ till DAPI.
Denna metod är kvalitativ snarare än kvantitativ som ljusare fluorescens kan bero på flera yta som exponeras antigena epitoper att erkännas i en enda antigen i förhållande till andra antigener lika överflöd men med färre exponerade ytan epitoper. Därför fluorescens intensitet kan endast användas för att jämföra reaktiviteten av samma antikroppar, såsom intakta kontra permeabilized celler och inte fluorescens intensiteter mellan olika proteiner. Denna distinktion är viktig när ett tvetydigt resultat erhålls då betydligt mindre fluorescens iakttas i intakta celler än i permeabilized celler (Fig. 2C). Ett sådant resultat indikerar att antingen proteinet är i underjordiska plats (med vissa icke-specifik bakgrundsfärgning av intakta celler), antikroppar binder företrädesvis till främmande epitoper som exponeras efter metanol permeabilization eller ett protein kan ha flera lokalisering webbplatser som beskrivs som för ERP och Elp proteiner annan spirochete, Borrelia burgdorferi 14. I båda fallen kräver en tvetydig IFA resultat som denna alternativa metoder såsom yta biotinylation eller yta proteolys att avgöra om proteinet av intresse är yta exponerad eller inte 10.
Figur 1. Flödesschema för ytan immuno-fluorescens analys av Leptospira interrogans spiroketer. För det första är 1 ml cellsuspension läggas i varje brunn på två brunnar kammare diabilder (minst två bilder för varje experiment) och inkuberas leptospira följa. Vidare är leptospira fast till kammare bilderna genom att tillsätta 1 ml / brunn av 2% paraformaldehyd (PFA) för prov med intakt yttre membran (OM) och 1 ml / brunn av 100% kall metanol för prov med permeabilized OM. Vidare är leptospira inkuberas med antikroppar erkänna yta exponerad proteiner tillsammans med kontroll antikroppar för ytan proteiner (Primary Ab: s) vid 30 ° C i 90 min. Sedan är primära antikroppar detekteras genom inkubering med 1 ml / brunn av Alexa Fluor 488 konjugerade sekundära antikroppar. Slutligen, celler kan göras synliga genom fluorescensmikroskopi.
Figur 2. Yta immunofluorescens analys av leptospiral proteiner. Leptospira interrogans spiroketer var sonderade med immunförsvaret och pre-immun sera och negativa resultat var ihopkopplad med en DAPI motfärg att påvisa förekomst av spiroketer. En grön fluorescens-filter användes för att upptäcka Alexa Fluor 488 märkta sekundära antikroppar binder till ytan utsätts proteiner och blå / cyan fluorescens-filter för att upptäcka DAPI bindning till DNA. A) leptospira sonderade med antikroppar erkänna en yta som exponeras protein OmpL54 10. B) Celler sonderade med antikroppar mot ett periplasmic subsurface protein, FlaA1 (negativ kontroll). C) Celler sonderade med antikroppar mot leptospiral Porin, OmpL1. Bindningen av kanin sera till leptospira upptäcktes med Alexa Fluor 488 konjugerat get-anti-kanin IgG fragment. Alla bilder är tagna efter 4 sek lång exponering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår yta IFA Tekniken liknar den som används för att visa på ytan exponering av olika borrelial 15, 16 och leptospiral 12, 17 proteiner. Detaljerna i ytan IFA-metoden som beskrivs här är utformade för att minimera manipulation av celler i ett försök att upprätthålla yttre membran integritet samtidigt dra nytta av tendens Leptospira celler att hålla sig till objektglas. Metoden innebär en lägre koncentration (2% respektive 4%) av paraformaldehyd, tvätt med ytter-membranstabiliserande buffert (PBS 5 mM MgCl 2) och färre tvätt steg än tidigare publicerade protokollen 12, 17. Dessutom understryker vår yta IFA-metoden betydelsen av kontroller som är nödvändiga för korrekta uppgifter tolkning. En begränsning med metoden är att den kräver tillgång till specifika antikroppar som kan känna igen yta exponerad epitopen (er) av proteinet av intresse. I vissa fall kan steriska hinder av andra ytproteiner eller lipopolysaccharider förhindra antikropp-antigen formation. Ändå är ytan IFA-metoden en relativt enkel teknik för att direkt bedöma exponeringsyta av proteiner och kan användas antingen som en fristående metod eller tillsammans med andra tekniker, såsom immunogold märkning, yta proteolys, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie fick stöd av Public Health Service bevilja AI-34.431 (till DAH) från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar samt VA Medical Research fonder (till DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M.
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A.
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A.
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
