Summary
Leptospiral proteinlerin yüzey pozlama değerlendirmek için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem özellikle kırılgan leptospiral hücrelerin dış membran kesintileri önlemek için tasarlanmıştır. Bu teknik, dış membran ve antikor reaksiyonu özgüllüğü bütünlüğünü değerlendirmek için birkaç negatif kontroller istihdam gerektirir.
Abstract
Bakteriyel yüzey proteinleri, konak hücreleri ile doğrudan temas halinde ve 1 çevre besin alımını ilgilidirler . Bu nedenle, hücresel yerleşimi bakteriyel proteinlerin fonksiyonel bir rol içgörüler sağlayabilir. Bakteri proteinleri Yüzey yerelleştirme patojenite mekanizmaları içinde yer virülans faktörleri belirlenmesi yolunda önemli bir adım.
Leptospiral membranlar 2-5 fraksiyonasyon Yöntemleri lipoproteinler transmembran OMPs vs gibi dış membran proteinleri (OMPs), belirli bir sınıf için seçici olması ve bu nedenle ması yol açabilir . Bu büyük olasılıkla yapısal farklılıklar ve dış membran ile ilişkili nedeniyle. Lipoproteinler, N-terminal lipid benzer parçaları (üç yağ asitleri) ve lipid bilayeri fosfolipit 6, 7 arasında bir hidrofobik etkileşim yoluyla membran ile ilişkilidir . Buna karşılık, transmembran OMPs genellikle β-yaprak amphipathic beşik gibi yapı 8, 9 düzenlenen çift katlı lipid içine entegre edilmiştir. Buna ek olarak, dış membran protein varlığı, protein ya da kendi etki alanı yüzeyinde maruz kaldığı garanti değildir. Spirochetal dış membranlar, alt yüzey proteini hücre ve içerme nazik manipülasyon içeren kırılgan ve bu nedenle gerektiren yöntemler olarak bilinen dış membran bütünlüğünü değerlendirmek için kontrol eder.
Burada, doğrudan sağlam leptospires proteinlerin yüzey maruziyeti değerlendirmek için immünofloresan assay (IFA) yöntemi mevcut. Bu yöntem, antijen-spesifik antikorların leptospiral yüzey proteinleri tanıma dayanır. Burada, 10 OmpL54 için spesifik antikorların yerli, yüzey maruz epitoplar aftero bağlayıcı detetcted. Sağlam karşı permeabilize hücrelerin antikor reaktivitesi karşılaştırılması bir protein seçici leptospiral yüzeyinde mevcut olup olmadığını ya da hücresel dağılımı değerlendirilmesini sağlar. Dış membran bütünlüğünü tercihen periplasm bulunan bir veya daha fazla yeraltı protein, antikor kullanarak bir şekilde değerlendirilmelidir.
Yüzey IFA yöntemi spesifik antikorların mevcuttur leptospiral protein yüzey maruz analiz etmek için kullanılabilir. Yöntemin kullanışlılığı ve sınırlama istihdam antikorlar yerli epitoplar bağlamak mümkün olup olmadığını bağlıdır. Rekombinant proteinler, yerli, yüzey maruz proteinlerin epitoplar karşı antikorları sıklıkla gündeme olduğundan kabul edilmeyecektir. Bununla birlikte, yüzey IFA yöntemi sağlam bakteriyel yüzeyler bileşenleri çalışmak için değerli bir araçtır. Bu yöntem sadece leptospires değil, aynı zamanda diğer spiroket ve gram-negatif bakteriler için değil uygulanabilir. OMPs yüzey pozlama ile ilgili güçlü sonuçlar için, birçok hücre lokalizasyon yöntemleri içeren geniş kapsamlı bir yaklaşım 10 tavsiye edilir .
Protocol
1. Cam slaytlar Leptospira fiksasyonu
- Leptospira interrogans BSL2 patojen bir sınıf. Canlı hücreler ile çalışma, eldiven, laboratuvar kat ve steril bir kaput pipetleme adımları uygun kullanım gerektirir.
- 30 ° C'ye ulaşana kadar orta-yaklaşık 6 gün geç-log fazı (5 x 10 8 hücre / ml 5 x 10 7 yoğunluğu)% 1 tavşan serumu ile desteklenmiş, EMJH medium11 Leptospira büyütün
- Oda sıcaklığında 7 dakika için ~ 2000 xg'de santrifüj kültür Hasat.
- Aspirasyon ile süpernatantı alın ve yavaşça tekrar süspansiyon fosfat pelet nihai konsantrasyonu 5 x 10 8 hücre / ml salin (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 tamponlu.
- Iki iyi oda cam slaytlar her bir kuyu için 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin ve 30 ° C'de 80 dk hücreleri uymak için izin verecek.
- Aspirasyon ile bağlanmamış hücreleri içeren sıvı dikkatlice çıkarın.
- 1 ml / PBS-5 mM MgCl 2% 2 paraformaldehid de ekleyerek, kalan sağlam bakteri cam slaytlar sabitleyin . 30 en az 40 dakika boyunca inkübe ° C. Bu slaytlar, yüzey maruz proteinleri değerlendirilmesi için.
- Alt-yüzey proteinleri değerlendirmek kontrol slaytlar için, buz, soğuk metanol 1 ml / 100% ile tespit dış membran permeabilize. -20 ° C'de 20 dakika inkübe edin. Metanol çeşitli şekillerde hareket eder, dış zar permeabilizes, proteinler denaturates ve cam slaytlar düzeltmeleri hücreleri.
- Aspirasyon ile ajanları tespit çıkarın.
2. Spesifik antikorların ile Etiketleme
- 1 ml / engelleme tamponu (Difco Leptospira Zenginleştirme EMJH) ekleyerek non-spesifik bağlama engelleyin. 30 ° C'de 90 dakika inkübe edin.
- Spesifik antikor (bağışıklık tavşan sera ya da fare monoklonal antikorlar, OmpL54 10 için özel burada poliklonal tavşan serumu, FlaA1 12, ve OmpL1 13) ve herhangi bir antikor içeren ön-immün tavşan sera veya fare sofu sıvı (negatif kontrol olarak kullanılan) sulandırınız tampon engelleme. Her antikor için çözeltiler ampirik hücre antijen-antikor reaktivite ve bol miktarda protein, antikor titresi bağlı olarak belirlenmelidir. Her zamanki aralığı 1:600 için 01:50.
- Aspirasyon engelleme tamponu çıkarın ve 1 ml / seyreltilmiş primer antikor ekleyin.
- 1s için 30 ° C'de inkübe edin.
- Aspirasyonu ile sıvı çıkarın ve kuyulardan PBS (1 ml / iyi) ile üç kez yıkayın.
3. Leptospires, görselleştirilmesi
- 1 ml / Alexa seyreltilmiş Fluor 488-etiketli sekonder antikor (keçi anti-tavşan IgG veya keçi anti-fare IgG ya) 1:2000 ve floresan nükleik asit leke, 4'6-diamidino-2-fenil-indol dihidroklorür (Ekle DAPI) 0.25 mcg / ml tampon engelleme nihai konsantrasyonu seyreltilmiş. Bu adım, antikor bağlayıcı ve bağlayıcı sırasıyla antikor bağımsız tüm spiroketlerine varlığı algılama sağlar.
- Slaytlar, 30 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
- Aspirasyonu ile sıvı çıkarın ve distile su (1 ml / kuyu) kuyular PBS ile iki kez ve bir kez yıkayın.
- Odaları ve cam slaytlar ve yaklaşık 10 dakika süreyle kurumaya yapışkan şeridi çıkarın.
- Altın anti-solmaya montaj orta (slayt başına 2 x 20 ul) ve 24 x 50 mm kapak kayma uzatmak ekleyin.
- Gece karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin. Bu adım, montaj orta (sertleşmesine) tedavi etmek için izin için gerekli.
- Oje ile kapak kayma Seal.
- DAPI için mavi / mavi bir algılama filtresi ve Alexa Fluor 488 yeşil bir algılama filtresi kullanarak floresan mikroskobu ile boyama gözünüzde canlandırın. Numunelerin doğru bir temsili yapılmış olduğundan emin olmak için, her numune için tüm oda alanını değerlendirmek emin olun.
- Görüntüleme, her örnek için bir temsilci alan verileri kaydedin. Görüntüleme Alexa Fluor 488 floresan, tüm örnekler için aynı pozlama süresi kullanın. Tutarlı bir pozlama süresi kullanma, test antijenlere karşı kontrolleri ile sonuçlarının daha doğru bir karşılaştırma sağlayacaktır.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Leptospira interrogans hücreleri ile yüzey ve alt yüzey proteinlerine karşı antikorlar kullanılarak yüzey IFA sonuçlarının örnekleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Önemli floresan bir protein yüzey maruz kalmaktadır (Şekil 2A) faiz sağlam leptospires örneklerinde tespit edildiğinde testi pozitif olarak kabul edilir. Genellikle, bir pozitif test (burada OmpL54 yüzey maruz kalan), yaklaşık aynı floresan bir yeraltı karşı antikor kullanarak dış membran bütünlüğü için bir negatif kontrol dahil etmek esastır (Şekil 2A), hem de sağlam ve permeabilize hücreler görülmektedir tercihen periplazmik, protein (örneğin leptospiral FlaA1 Şekil 2B). Veri dış zarı bozulmadan duri kalmıştır sadeceng deneyi, yani bir alt yüzey proteinine karşı antikorların sağlam hücreleri (Şekil olarak permeabilize örnek kıyasla floresan veya çok zayıf floresan. 2B) tepkimeye girmeyen, ilgi protein (ler) olduğu söylenebilir. yüzey maruz. Net veriler için ek bir negatif kontrol olarak önceden bağışıklık serumları (poliklonal antikor durumda) ile deneyler dahil edilmesi esastır ve bozulmamış veya permeabilize hücreleri (Şekil 2A, 2C) önemli floresan vermeyecektir. Leke DAPI olumsuz sonuçlar gözlenmiştir (no Alexa Fluor 488 floresan) leptospires görselleştirmek için gerekli. Propidium iyodür ile Counterstaining DAPI için kabul edilebilir bir bir alternatif.
Bu yöntem, eşit bolluk diğer antijenlere göre tek bir antijen ama daha az yüzey maruz epitoplar kabul edilmesi antijenik epitoplar maruz birden fazla yüzeye bağlı olabilir nitel yerine parlak floresan gibi nicel. Bu nedenle floresan yoğunlukları farklı proteinler arasında sağlam karşı permeabilize hücreleri ve floresan değil şiddetleri aynı antikorlar, reaktivite karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu ayrım, önemli ölçüde daha az floresan permeabilize hücreleri (Şekil 2C) daha sağlam hücrelerinde gözlenen olduğu belirsiz bir sonuç elde edilir önemlidir. Böyle bir sonuç ya da protein (sağlam hücreleri bazı non-spesifik bir arka plan boyama) bir alt-yüzey yeri olduğunu gösterir, antikorlar birden fazla olabilir tercihen metanol permeabilization veya bir protein sonra maruz kalan yerli olmayan epitoplar bağlayıcıdır lokalizasyon siteleri gibi başka bir spirochete, Borrelia burgdorferi 14 Erp ve Elp proteinler tanımlanmıştır. Her iki durumda da, bu gibi belirsiz bir IFA sonucu faiz protein yüzey maruz kalan ya da 10 olup olmadığını belirlemek için, yüzey biyotinilasyon veya yüzey proteoliz gibi alternatif yaklaşımlar gerektirir.
Şekil 1. Leptospira interrogans spiroketlerine immuno-floresans test yüzey akış şeması. Birincisi, her iki iyi oda slaytlar iyi 1 ml hücre süspansiyonu eklendi (her bir deney için en az iki kaydıraklı) ve uymaları leptospires inkübe. Sonra, leptospires sağlam dış membran (OM) ve permeabilize OM örnekleri için 1 ml / 100% soğuk metanol ile numuneleri için 1 ml /% 2 paraformaldehid (PFA) ekleyerek odasına slaytlara sabitlenir. Sonra, leptospires 30 yeraltı proteinleri (İlköğretim Ab) ° C de 90 dakika boyunca kontrol antikorlar ile birlikte yüzey maruz proteinleri tanıyan antikorlar ile inkübe edilir. Daha sonra, primer antikorlar 1 ml / Alexa Fluor 488 konjuge sekonder antikor ile inkübasyon tarafından tespit edilir. Son olarak, hücreler floresan mikroskopi tarafından görüntülenmiştir.
Şekil 2 leptospiral proteinler Yüzey immünofloresan analiz. Leptospira interrogans spiroketlerine bağışıklık ve ön-immün sera probed ve olumsuz sonuçlar spiroketlerine varlığını göstermek için bir DAPI counterstain ile eşleştirilmiş. Yeşil floresan filtre Alexa Fluor 488 hücre DNA bağlayıcı DAPI tespit maruz kalan proteinler ve mavi / camgöbeği floresan filtre yüzey bağlayıcı etiketli ikincil antikor tespit etmek için kullanılmıştır. A) Leptospires bir yüzey maruz protein, OmpL54 10 tanıyarak antikorlar araştırdı. B) Hücreler periplazmik yeraltı protein, FlaA1 (negatif kontrol) karşı antikorlar ile araştırdı. C) Hücreler leptospiral porin, OmpL1 karşı antikorlar ile araştırdı. Leptospires tavşan sera Cilt Alexa Fluor 488 konjuge keçi anti-tavşan IgG parçaları tespit edildi. Tüm görüntüler 4 sn uzun maruz kaldıktan sonra alınır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim yüzey IFA tekniği çeşitli borrelial 15, 16 ve leptospiral 12, 17 proteinler yüzeye maruz göstermek için kullanılan benzer. Burada anlatılan yüzey IFA yöntemi cam slaytlara uygun Leptospira hücrelerinin eğilim yararlanarak dış membran bütünlüğünü korumak için bir çaba hücrelerin manipülasyonu en aza indirmek için tasarlanmış. Bu yöntem, dış membran stabilize tamponu (PBS 5 mM MgCl 2) ve daha az yıkama adımları ile yıkanarak paraformaldehid protokolleri 12, 17 daha önce yayınlanmış daha düşük konsantrasyonda (% 4 karşısında% 2), içerir . Buna ek olarak, yüzey IFA yöntemi doğru veri yorumlama için gerekli kontrollerinin önemini vurgulamaktadır. Yöntemin bir sınırlaması, ilgi protein epitopu (ler) yüzey maruz tanıma yeteneğine sahip olan özel antikorların mevcudiyeti gerektirir. Bazı durumlarda, diğer yüzey proteinleri veya lipopolisakkaridinin sterik engel antikor-antijen oluşumunu önleyebilir. Bununla birlikte, yüzey IFA yöntemi doğrudan proteinlerin yüzey maruziyeti değerlendirmek için oldukça basit bir tekniktir ve bağımsız bir yaklaşım olarak veya immunogold etiketleme, yüzey proteolize, vb gibi diğer teknikler, konser ya da kullanılabilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada, Halk Sağlığı Servisi hibe tarafından desteklenen AI-34431 Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve VA Tıp Araştırma Fonu (DAH) (DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M.
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A.
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A.
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
