Summary
研究では、MSTのツールとして提案したヒト/ブタ/ウシDNAウイルス、アデノウイルスとpolyomaviruses、特定の定量化のために定量PCRを用いて水中の硝酸塩による尿/糞便汚染または汚染源の同定のための費用対効果の高い方法を説明します。
Abstract
環境の微生物汚染は重大な健康上のリスクを表しています。古典的な細菌の糞便指標が重要な限界があることが示されている、ウイルスが汚染源に通知していない多くの不活性化プロセスと標準の糞便の指標に対してより耐性があります。費用対効果の高い水からのウイルスの濃度のための方法と分子アッセイの開発は、糞便汚染の指標として、微生物源の追跡（MST）ツールとしてウイルスの適用を容易にします。アデノウイルスとpolyomavirusesは、ヒトを含む特定の脊椎動物に感染するDNAウイルスであり、永続的に糞及び/または調査したすべての地理的領域における尿中に排泄される。以前の研究では、我々は人間の糞便汚染の指標として定量PCR（qPCR）により、ヒトアデノウイルスの定量化（HAdV）とJCのpolyomaviruses（JCPyV）を提案した。最近、我々は、PORの特定の定量化のためのqPCRアッセイを開発しました。試験管当たり1〜10ゲノムコピーの感度と汚染の動物糞便のマーカーとしてシネアデノウイルス（PAdV）とウシpolyomaviruses（BPyV）。本研究では、我々はこれらのツールを使用して水試料中の汚染源を特定するために従うべき手順を示します。代表的な成果の例として、硝酸塩の高いレベルを提示する地下水のウイルスの分析が示されています。
低または中程度に汚染された水域でのウイルスの検出は、はるかに少ない量に水の少なくとも数リットルからのウイルスの濃度、通常は直列の2つの濃度のステップが含まれている手順が必要です。この少々面倒な手順やウイルスの回収率で観察された変動は大幅に水の多数のサンプルの同時処理を妨げる。
我々は以前のstudieで開発したワンステップのプロトコルを適用した二段階の手続きによって生じるボトルネックを解消するためにsと水マトリックスの多様性に適用される。十リットルの水試料の酸性化、スキムミルクで凝集、凝集物質の重力沈降、沈殿と遠心分離のコレクション、10 mlのリン酸緩衝液中の沈殿物の再懸濁を：手順が含まれています。ウイルス濃縮液は、ウイルス核酸の抽出に使用され、関心のある特定のアデノウイルスとpolyomavirusesは、定量PCRにより定量化されています。サンプル数が多いが、同時にこの低コストの濃縮法を用いて解析することができます。
手順は、入浴の海、海水や河川水の分析に適用し、本研究では、我々は、地下水のサンプルを分析結果を提示されています。このハイスループット定量法は、信頼性の高い簡単な、そして費用対効果の高いです。
Protocol
1。水試料中に存在するウイルス粒子の濃度
- 水試料の収集とコンディショニング
- 2の最小値を収集するプロセス制御などの平らな底部及びつの余分なサンプルをプラスチック容器内の試料あたり10 Lの複製。この最後のサンプルは、ウイルス粒子の既知量をスパイクし、コントロールとして使用されます。
注：これは、添加サンプルのための特別な別の材料を（瓶、チューブ、など）を使用することが推奨されます。 - conductimeterのキャリブレーションを確認し、必要に応じて再キャリブレーション。つの余分なプラスチック製の10リットルの容器で、以前に十分な導電率に調整した水道水を（1.6下記参照）を使用してネガティブコントロールを用意します。
- 添加サンプルの場合：サンプルにコントロールウイルスの標準量（水10Lあたり約10 5ゲノムコピー）を追加します。回避飛散やエアロゾルを攪拌して混ぜる。ポジティブコントロールは、アデノウイルスsの珍しい株で構成されています可能性がHAdV - 35またはMS2のようなバクテリオファージとしてUCH。
- サンプルは、浮遊物質（砂または他の材料）の高い量を提示した場合、15分間堆積物にしましょう。新しい容器に水を移す。
- 1 N HClの添加によって3.5（± 0.1）に水試料のpHを調整します。このステップでは、ウイルスの濃度が重要であるので、pHを適切に調整されていることを確認してください。 HClを添加しながら激しく撹拌しながらで十分に水を混ぜる。 （注：pH値は3.5追加1 M水酸化ナトリウムより低い場合）。
- 導電性を調整します。サンプルは、1500μS/ cm以上の導電性を持っている場合、この手順は不要です。伝導率が1500μS/ cmの凝集物質の形成（フロック）が保証されていないよりも低い場合は人工的な海の塩（シグマ）を添加することによって1500μS/ cmの導電率を調整する。海の塩を加えながら撹拌することにより、積極的に混ぜる。
- エアコンの前と後のサンプルのpHを記録するだけでなく、使用される塩酸のsはボリューム。導電率は、pHを調整した後、記録されるべきである。常に新鮮なHCl溶液でpHメーターとconductimeter電極を消毒、10％ナトリウムtiosulphate液で塩素を除去すると、最後に蒸留水ですすいでください。
- 2の最小値を収集するプロセス制御などの平らな底部及びつの余分なサンプルをプラスチック容器内の試料あたり10 Lの複製。この最後のサンプルは、ウイルス粒子の既知量をスパイクし、コントロールとして使用されます。
- あらかじめ凝集1パーセントスキムミルクの準備（PSM）
- pHメーターとconductimeterのキャリブレーションを確認し、必要に応じて再キャリブレーション。
- 1リットルの人工海水に10グラム脱脂粉乳（ディフコ）を溶解することによって事前に凝集したスキムミルク溶液（1％PSM、w / v）の準備（脱塩素水道水とオートクレーブ1Lに人工的な海の塩の33.3 gを溶解）し、慎重に1N HClで3.5にpHを調整する。フロックが表示されるはずです。 4で使用または保管される直前に溶液を調製℃で24時間インキュベートする。脱塩素のために水100mlあたり10％のtiosulphate溶液1mlを使用してください。
- 水試料中に存在するウイルス粒子の凝集
- 10 - Lの水サンプルを1％のPSMの100 mlを追加します。
- フロックに吸着するウイルスを可能にするために80〜10時間のサンプルをかき混ぜる。 80から10時間後に攪拌をオフにするタイマーを使用
- 攪拌を停止し、80〜10時間撹拌重力によるフロック沈降をしましょう
- フロックを収集し、再溶解する。遠心分離
- ペリスタルティックポンプとプラスチック製のチューブに接続されているプラスチック製のピペットを用いて上清を取り除く。添加サンプルのために上清は、ボトルと内部手続きに従って消毒に収集する必要があります。すべてのケースではペレットを集めるように注意してください。
- 遠心ボトルにフロックと堆積物（約500 ml）を収集する。
- PSMのpHを3.5の添加により鉢のバランスをとる。
- 4時30分、8,000 xgで高速遠心機でポットを遠心℃にとすぐに遠心分離機が停止するように、慎重に遠心から遠心ポットを削除します。
- 非常にグラムently捨て、上清を捨てる。感染性物質のための適切な措置に従ってください。
- 各遠心ボトルにペレットを溶解するリン酸緩衝液7 mlを追加します。
- フロックが溶解された後、測定し、10 mlの全体積に到達するためのリン酸緩衝液を加える。
- ボルテックスによるウイルス濃縮物をホモジナイズし、さらなる分析に必要になるまで-80℃で凍結する必要があるきれいなマイクロチューブに10 mlを配布する。
2。核酸抽出
- 製造元の指示に従って別途準備ウイルスRNAミニキットでの核酸抽出を行います。このキットは、自動化されたプラットフォーム（などQiacubeなど、キアゲン）の使用が可能になります。
3。ヒトアデノウイルスの定量的PCR（HAdV）、JCのpolyomaviruses（JCPyV）、ブタアデノウイルス（PAdV）とウシpolyomaviruses（BPyV）
- サンプル中のゲノムコピーの定量化
- 準備のTaqMan環境PCRマスターミックス2倍に（Applied Biosystems社）を使用して、クリーンな別々の領域で定量PCRミックス。反応は、光学接着剤のカバーで覆われた96ウェル光学反応プレートで行われます。マスターミックスの濃度は、プライマーおよびプローブは、表1で説明されています。
- 一度ミックスはよく（3.2参照）、コントロールを含めてそれぞれに、アリコート15μlを準備している。ターゲットの追加後に一つの反応の合計量は、（15μlのミックス+10μlのサンプルまたは標準）25μlのようになります。
- 別のエリア内のサンプル（10μL）からの核酸抽出を追加。直接実行し、重複して各サンプルの精製水で10倍希釈。接着剤カバーの一部のサンプルを含むウェルをカバーする、次のステップのためにカバーの他の部分を保持します。
- 三連で10 0〜10 6GC/10μlからのDNAの標準懸濁液（10μlの）の希釈液を追加し、排他的に標準に使用するマイクロピペットを用いて標準のDNA。プラスミドDNAを破壊し、それぞれの使用後にマイクロピペットをきれいにするためのUV照射を装備した領域での規格を追加することをお勧めします。プレカット接着剤のカバーと基準を含むウェルをカバーしています。
注：ゲノムコピーの定量化に使用される標準的な懸濁液を調製するためには、標的DNA領域はプラスミドと直鎖状にクローン化されるべきである。以下のアドレスでは、定量PCRに使用するプラスミドDNAのテンプレートを使用して標準曲線を作成する方法についての詳細な手順を見つける：
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - 適切なパラメータを（接着剤カバーと各ウェルの総容積の使用、などを考慮して）選択して適切なシステムに定量PCRを行います。 95℃で10分間のAmpliTaq Goldの次の活性化° C、増幅の40サイクル、次のように実行されています：95 ° Cで15秒と1 60 minでHAdV、JCPyVとBPyVのためのC、および95℃、55℃20℃と60℃PAdVのためのCで20歳代で15秒。
- 使用される機器の取扱説明書で説明されているように反応は、ストアのデータと結果を完了したら。 DNA量は、必要に応じて希釈率を修正した後、得られたデータの中央値として定義されます。
- コントロール
- ポジティブとネガティブコントロールを使用してください。アッセイは、ミックスが蛍光を生成しないことを証明するために複数の非テンプレートコントロール（NTC）を含める必要があります。研究試料中に存在する阻害剤に起因する潜在的な酵素阻害を評価するために、正のプロセス制御を実行することをお勧めします。
- 標準DNAのおよびプロセス制御から2つの異なる希釈液のqPCRアッセイの結果を記録。アッセイの感度および効率に関係する品質管理（QC）プログラムのために管理図を準備するために、結果を使用してください。
- の確認結果は
- 肯定的な結果は、さらに1,5,6,7,9,12を検出した菌株の塩基配列に関する追加データを生成する、アンプリコンのネスト- PCRと塩基配列を用いて確認することができます。
説明した手順に従って、人間と動物のウイルスは、入浴の海、海水や河川水2,3で検出し、定量化されています。代表的な例として、硝酸塩の高いレベルを提示する分野から地下水試料は、汚染の発生源を定義するために評価した。十リットルの水のサンプルは、スペイン北東部の農村部における4つの井戸から採取された。五は、プロセス制御として使用されるヒトアデノウイルス2で播種した各ウェルと1つの複製に収集された複製。サンプルを図1に表されたプロトコルに従って処理した。 4人は（値7.7平均PAdVための肯定的な結果を示した研究4つのサイトのいずれかで分析した複製サンプリングサイトを周辺地域における豚スラリーの存在に関連されると地下水の硝酸塩（表2）のソースとして糞便ブタの汚染をサポートする4 × 2 GC / L）。
4。代表的な結果：
図1水中ウイルスの検出および定量するための手順。
qPCRアッセイ用のプライマーとプローブの表は、1。集中。
表2。検出と地下水試料中の動物やヒトアデノウイルスとpolyomavirusesの定量化。
のn個の数は、分析複製
正の％の割合では、複製
（ - ）検出された非
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
再現性、信頼性の高い、簡単で、費用対効果：説明する手順では、ルーチン、環境および公衆衛生研究所のためのフィッティング方法のための条件を満たすでしょう。プロトコルはシンプルですが、それは注意深く従ってください。凝集のための攪拌時間を大幅に（たとえば5時間未満）減少する場合のように人工海水の塩の要求された濃度を加えることなく、試料中の低導電率が飛躍的にウイルスの回収を減らすことができます。
現在適用されているMSTのツールは、一般的に分子生物学的手法に基づいています。異なるグループによって開発された研究では、必要に応じて、現在使用されているパラメータのうち5.0（すなわち細菌の遺伝子が）どれものような特定がないことが示されている。したがって、これらのパラメータの組み合わせの使用は、水域8,11の糞便汚染の起源を効率的に追跡するための最良の近似値として提案されている。
近年jove_content">、多くの場合、臨床症状がない場合の永続的な感染症を生成する選択したDNAウイルスの研究は、環境でソースの追跡糞便汚染のための方法として浮上している。定量的PCR技術と提案した濃縮法は、これらのウイルスの濃度の信頼性の高い値とリスクアセスメントの調査および改善措置の開発のための非常に貴重なデータを提供しています。これらの技術はまた、高感度および特異的な、汚染の源を追跡するための絶対条件である。また、彼らは予定多様な地理的領域での微生物ソース追跡ツールとして提案された特定のウイルスの排泄と普及の定量的特徴づけのため大規模なデータベースを生成するための非常に有用なツールとなる。説明する手順では、労働集約的要件なしで約48時間で同時に複数のサンプルの分析が可能S.効率的な低コストの濃縮方法の可用性は、定量的な微生物ソース追跡調査と地下水の汚染物質の起源の同定のための費用対効果の高いアッセイとしてHAdVとJCPyVの適用性をサポートし、水でPAdVとBPyV。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
二つの特許出願は、PAdVとBPyVの定量化のためのプロトコルの知的財産を保護するために2009年に提起された。
Acknowledgments
この研究の一部は、欧州連合（EU）の研究枠組み7資金プロジェクトは、（契約番号513648）VIROBATHE、VIROCLIME（契約番号は243923で、スペイン政府は"保健省ドEducación Y Ciencia"（プロジェクトAGL2008-05275-C01/ALI）によってサポートされていました）と水のカタロニア庁、AgènciaカタラーナドゥAigua（ACA）、Departamentド制御I Millora DELS Ecosistemes水泳で。開発研究の間マルタルシニョールはカタロニア政府"AGAUR"（FI - DGR）の仲間だった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
