Summary
I studien beskriver en kostnadseffektiv metod för identifiering av källan till fekal / urin förorening eller kontaminering av nitrater i vatten med qPCR för den specifika kvantifiering av humant / svin / nötkreatur DNA-virus, adenovirus och polyomaviruses, föreslås som MST verktyg.
Abstract
Mikrobiell förorening av miljön utgör en betydande hälsorisk. Klassisk bakteriell fekal indikatorer har visat sig ha stora begränsningar, virus är mer resistenta mot många inaktivering processer och standard fekal indikatorerna inte informera om föroreningskällan. Utvecklingen av kostnadseffektiva metoder för koncentrationen av virus från vatten och molekylära analyser underlättar tillämpningen av virus som indikatorer på fekal förorening och som mikrobiell källa tracking (MST) verktyg. Adenovirus och polyomaviruses är DNA-virus infekterar vissa ryggradsdjur inklusive människa och är ständigt utsöndras i avföring och / eller urin för alla studerade geografiska områden. I tidigare studier föreslog vi kvantifiering av humant Adenovirus (HAdV) och JC polyomaviruses (JCPyV) genom kvantitativ PCR (qPCR) som ett index av mänsklig fekal förorening. Nyligen har vi utvecklat realtids-PCR-analyser för den specifika kvantifiering av porcine Adenovirus (PAdV) och bovin polyomaviruses (BPyV) som djur fekal markörer för kontaminering med känslighet 1-10 genomet exemplar per provrör. I denna studie presenterar vi det förfarande som skall följas för att identifiera föroreningskällan i vattenprover med hjälp av dessa verktyg. Som exempel på ett representativt resultat är analys av virus i grundvatten presentera höga halter av nitrat visas.
Detektion av virus i låga eller måttligt förorenade vatten kräver koncentration av virus från minst flera liter vatten i en mycket mindre volym, ett förfarande som normalt omfattar två koncentrationen steg i serien. Denna något omständligt förfarande och variabiliteten hos virus återvinningar försvårar avsevärt samtidig bearbetning av ett stort antal vattenprover.
För att eliminera flaskhalsen som orsakas av förfarande i två steg har vi tillämpat en ett steg protokoll som utvecklats i tidigare Studies och gäller för en mångfald av vatten matriser. Förfarandet omfattar: försurning av tio liter vatten prover, flockning med skummad mjölk, allvaret sedimentering av flockade material, insamling av fällningen och centrifugering, resuspension av fällningen i 10 ml fosfatbuffert. Den virala koncentratet används för utvinning av virala nukleinsyror och specifika Adenovirus och polyomaviruses av intresse kvantifieras av qPCR. Stort antal prover kan samtidigt analyseras med denna billiga koncentration metoden.
Förfarandet har tillämpats vid analys av badvatten, havsvatten och flodvatten och i denna studie presenterar vi resultaten analyseras grundvattnet prover. Denna high-throughput kvantitativ metod är tillförlitlig, enkel och kostnadseffektiv.
Protocol
1. Koncentration av viruspartiklar som finns i vattenprover
- Insamling och konditionering av vattenprov
- Samla minst 2 replikat av 10 L per prov i plastbehållare med platt botten och ett extra prov som en process kontroll. Det sista provet kommer att bli spetsad med en känd mängd viruspartiklar och används som en kontroll.
OBS: Det är rekommenderat att ha speciella separata material (flaskor, rör, etc.) för spetsade prover. - Kontrollera kalibreringen av conductimeter och kalibrera vid behov. Förbered en negativ kontroll genom att använda kranvatten tidigare justerade till lämplig konduktivitet (se nedan 1.6) i en extra plast 10 L behållare.
- För spetsade prover: Lägg standarden volym kontroll viruset (ca 10 5 genomet kopior per 10 L vatten) till provet. Blanda genom att skaka om att undvika stänk och aerosoler. Positiva kontrollerna kunde bestå i en ovanlig stam av adenovirus sUCH som HAdV-35 eller en bakteriofag som MS2.
- Om provet visar höga mängden suspenderat material (sand eller annat material), låt det sediment i 15 minuter. Överför vattnet till en ny behållare.
- Justera pH-värdet i vattnet prov till 3,5 (± 0,1) genom tillsats av 1 N HCl. Detta steg är viktigt för koncentrationen av virus, så se till att pH-värdet rätt har justerats. Blanda vatten noggrant genom kraftig omrörning samtidigt lägga till HCl. (Obs! Om pH är lägre än 3,5 tillsätt 1 M NaOH).
- Justera ledningsförmåga. Om provet har en konduktivitet på 1500 uS / cm eller högre, är detta steg inte behövs. Om konduktiviteten är lägre än 1500 uS / cm bildandet av flockade material (flockar) kan inte garanteras så justera ledningsförmåga till 1500 uS / cm genom tillsats av konstgjorda sjö salter (Sigma). Blanda den kraftigt omrörning samtidigt lägga havet salter.
- Rekord pH i proverna före och efter konditionering samt ens volym HCl som används. Konduktiviteten ska också registreras efter justering av pH. Alltid desinficera pH-mätare och conductimeter elektroder med en fräsch HCl lösning dechlorinate med 10% natrium tiosulphate lösning och slutligen skölj med destillerat vatten.
- Samla minst 2 replikat av 10 L per prov i plastbehållare med platt botten och ett extra prov som en process kontroll. Det sista provet kommer att bli spetsad med en känd mängd viruspartiklar och används som en kontroll.
- Beredning av pre-flockade 1% skummjölk (PSM)
- Kontrollera kalibrering av pH-mätare och conductimeter och kalibrera vid behov.
- Förbered före flockade skummjölk lösning (1% PSM, w / v) genom att lösa 10 g skummjölkspulver (Difco) i 1 l konstgjort havsvatten (lös 33,3 g konstgjord sjö salter i 1 l avklorerat kranvatten och autoklav) och noggrant justering av pH till 3,5 med 1N HCl. De flockar ska vara synligt. Bered lösningen precis innan för att användas eller förvara vid 4 ° C i 24 h. För dechlorination använda 1 ml 10% tiosulphate lösning per 100 ml vatten.
- Flockning av viruspartiklar som finns i vattenprover
- Tillsätt 100 ml 1% PSM till 10-L vattenprov.
- Rör om prover för 8-10 timmar så att virus att bindas till de flockar. Använd en timer för att avstängning av omrörning efter 8-10 h.
- Stoppa omrörning och låt flockar sediment av gravitation i 8-10 h.
- Insamling och åter upplösa flockar. Centrifugering
- Avlägsna supernatanten med hjälp av en peristaltiska pump och en plastpipetten ansluten till ett plaströr. För spetsade prover supernatanten bör samlas i en flaska och desinficeras enligt interna rutiner. I samtliga fall TA HAND inte att samla pelleten.
- Samla sedimentet med flockar (ca 500 ml) i en centrifug flaska.
- Balansera krukor genom tillsats av PSM pH 3,5.
- Centrifugera krukor i en hög hastighet centrifugera vid 8000 xg under 30 min vid 4 ° C. Så fort centrifugen stannar, försiktigt bort centrifugen krukor från centrifugen.
- Mycket gently Häll av och kassera supernatanten. Följ lämpliga åtgärder för infektiöst material.
- Tillsätt 7 ml fosfatbuffert till lös pelleten i varje centrifug flaska.
- När flockarna har upplösts, mäta och lägga fosfatbuffert för att nå en total volym på 10 ml.
- Homogenisera virusets koncentrera sig genom att vortexa och distribuera 10 ml i ren mikrorör som bör frysas vid -80 ° C tills det behövs ytterligare analys.
2. Nukleinsyra extraktion
- Utför en nukleinsyra extraktion med QIAamp RNA Mini Kit efter tillverkarens instruktioner. Detta kit möjliggör användandet av en automatiserad plattform (som Qiacube, Qiagen).
3. Kvantitativ PCR mänskliga Adenovirus (HAdV), JC polyomaviruses (JCPyV), svin Adenovirus (PAdV) och bovin polyomaviruses (BPyV)
- Kvantifiering av genomet exemplar i proverna
- Förberedden qPCR blanda i en ren separat område med TaqMan Miljö-PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Reaktionen sker i en 96-såväl optiska mothållsplattan täckt med optisk lim täcker. Koncentrationer av Master Mix är primers och prober som beskrivs i tabell 1.
- När blandningen har beretts, alikvot 15μl i varje brunn inbegripet de kontroller (se 3.2). Den totala volymen för en reaktion efter tillägg av målet kommer att 25μl (15μl mix + 10μl prov eller standard).
- Lägg till nukleinsyra utdrag från proverna (10μl) i ett separat område. Kör direkt och en tiospädning i renat vatten för varje prov i två exemplar. Täck brunnarna innehåller proven med en del av ett lim täcker, hålla den andra delen av locket för följande steg.
- Tillsätt utspädningar av suspensioner DNA-standarden (10μl) från 10 0 till 10 6 GC/10μl med tre exemplar och med hjälp av en mikropipett uteslutande används för STANdard DNA. Det är lämpligt att lägga till standarder i ett område utrustad med UV-strålning för att förstöra plasmid DNA och att rengöra mikropipett efter varje användning. Täck brunnarna innehåller standard med färdigskurna självhäftande lock.
OBS: För att förbereda standard suspensioner att användas i kvantifiering av genomet kopior bör mål-DNA regionen klonas in i en plasmid och linjär. På följande adress hittar du ett detaljerat förfarande för hur du skapar standard kurvor med plasmid-DNA mallar att användas i qPCR:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Utför qPCR till ett lämpligt system att välja lämpliga parametrar (överväger att använda lim locket och den totala volymen i varje brunn, etc). Efter aktivering av AmpliTaq Gold i 10 min vid 95 ° C, 40 cykler av förstärkningen sker enligt följande: 15 s vid 95 ° Coch 1 min vid 60 ° C för HAdV, JCPyV och BPyV och 15 s vid 95 ° C, 20-årsåldern vid 55 ° C och 20-talet vid 60 ° C för PAdV.
- När reaktionerna är klar lagra data och resultat som beskrivs i bruksanvisningen för den utrustning som används. Mängden DNA kommer att definieras som medianen av de data som erhållits efter korrigering spädningsfaktorn när det behövs.
- Kontroller
- Använd positiva och negativa kontroller. Analysen måste omfatta mer än en icke-mall kontroll (NTC) att bevisa blanda inte ger fluorescens. Det är tillrådligt att köra den positiva processtyrning för att utvärdera potentiella enzymatisk inhibition pga hämmare som finns i de studerade proverna.
- Rekordresultat för qPCR analyser av två olika spädningar av standarden DNA och från processtyrning. Använd resultaten för att förbereda styrdiagram för kvalitetskontroll (QC) program i samband med känslighet och effektivitet analyser.
- Bekräftelse avresultat
- Positiva resultat kan ytterligare bekräftas med kapslade-PCR och nukleotidsekvensering av amplicons upptäckte 1,5,6,7,9,12 fram ytterligare data om nukleotidsekvenser av stammarna.
Efter den beskrivna metoden har människors och djurs virus upptäckts och kvantifieras i badvatten, havsvatten och flodvatten 2,3. Som representant exempel var grundvatten prover från områden presenterar höga nivåer av nitrat utvärderas för att definiera källorna till förorening. Tio liter vatten togs från 4 olika brunnar på landsbygden i ett nordöstra regionen i Spanien. Fem replikat togs i varje brunn är en replikera ympats med humant adenovirus 2 används som processtyrning. Proverna behandlas enligt protokollet representerade i figur 1. De fyra replikat analyseras i ett av de studerade fyra platser visade positiva resultat för PAdV (medelvärde 7,74x10 2 GC / L) som skulle vara relaterad till förekomsten av gris slurry i områdena kring provtagning platsen och skulle stödja fekal svin föroreningar som källan till nitrat i grundvatten (tabell 2).
4. Representativa resultat:
Figur 1. Förfarande för detektering och kvantifiering av virus i vatten.
Tabell 1. Koncentrationen av primers och prober för qPCR analyser.
Tabell 2. Detektion och kvantifiering av djurs och människors Adenovirus och polyomaviruses i prover grundvatten.
n antal replikat analyserats
% Andel positiva replikat
(-) Icke upptäckta
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det förfarande som beskrivs skulle uppfylla villkoren för en passande metod för rutinmässig miljön och folkhälsan laboratorier: reproducerbar, tillförlitlig, enkelt och kostnadseffektivt. Protokollet är enkelt, men det måste följas noggrant. Låg konduktivitet i proverna utan att lägga den begärda koncentration av konstgjorda havsvatten salter skulle dramatiskt minska återvinning av virus som skulle vara fallet om omrörning tid för flockning minskar avsevärt (mindre än 5 timmar till exempel).
Närvarande tillämpas MST verktyg är i allmänhet baserade på molekylära tekniker. Studier som utvecklats av olika grupper har visat att av de närvarande används parametrar (dvs. bakteriella gener) ingen är så specifik som behövs. Således använder en kombination av dessa parametrar har föreslagits som den bästa approximation för en effektiv spårning av ursprunget till fekal förorening i vattendragen 8,11.
jove_content "> På senare år har studien av de utvalda DNA-virus som ger i många fall ihållande infektioner i frånvaro av kliniska symtom, framträtt som en metod för source-tracking fekal förorening i miljön. Kvantitativ PCR-teknik och koncentrationen föreslagna metoden ger tillförlitliga värden av koncentrationen av dessa virus och mycket värdefulla uppgifter för utvecklingen av riskbedömning studier och åtgärder sanering. Dessa tekniker är också mycket känslig och specifik, vilket är ett absolut krav för att spåra källan till föroreningen. Dessutom kommer de att vara ett mycket användbart verktyg för generering av stora databaser för kvantitativ karaktärisering av utsöndring och spridning av specifika virus föreslagits som mikrobiell källa-tracking verktyg i olika geografiska områden.Det förfarande som beskrivs kan analys av flera prover samtidigt i ca 48 timmar utan intensivt arbete krävsS. Tillgången till en effektiv låg kostnad koncentration metodstöd tillämpligheten av HAdV och JCPyV och PAdV och BPyV i vatten så kostnadseffektivt analyser för kvantitativ mikrobiell källa för spårning och identifiering av ursprunget till föroreningar i grundvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Två patentansökningar lämnades in under 2009 för att skydda immateriella rättigheter protokoll för kvantifiering av PAdV och BPyV.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis stöd av den spanska regeringen "Ministerio de Educación y Ciencia" (projekt AGL2008-05275-C01/ALI), av Europeiska unionens ramprogram för forskning 7 projekt VIROBATHE (Kontrakt nr 513.648), VIROCLIME (Kontrakt nr 243.923 ) och av den katalanska byrån Vatten, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de styr jag Millora dels Ecosistemes Aquatics. Under utvecklat studien Marta Rusiñol var en karl i den katalanska regeringen "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
