Summary
De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.
Abstract
Microbiële besmetting van het milieu is een belangrijke risico voor de gezondheid. Klassieke bacteriële fecale indicatoren getoond om significante beperkingen hebben, virussen beter bestand tegen vele inactivatie processen en standaard fecale indicatoren niet te informeren over de bron van besmetting. De ontwikkeling van kosteneffectieve methoden voor de concentratie van virussen uit het water en moleculaire assays vergemakkelijkt de toepasbaarheid van virussen als indicatoren van fecale verontreiniging en als microbiële bron tracking (MST) tools. Adenovirussen en polyomavirussen zijn DNA-virussen infecteren specifieke gewervelde diersoorten waaronder de mens en zijn voortdurend uitgescheiden in de feces en / of urine in alle bestudeerde geografische gebieden. In eerdere studies, hebben we voorgesteld de kwantificatie van menselijke adenovirussen (HAdV) en JC polyomavirussen (JCPyV) met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) als een index van de menselijke fecale verontreiniging. Onlangs hebben we qPCR assays voor de specifieke kwantificering van porcine adenovirussen (PAdV) en runderen polyomavirussen (BPYV) als dierlijke fecale markers van besmetting met de gevoeligheden van 1-10 exemplaren van het genoom per reageerbuis. In deze studie presenteren we de procedure die moet worden gevolgd om de bron van de besmetting van water monsters met behulp van deze tools te identificeren. Als voorbeeld van de representatieve resultaten, is de analyse van virussen in het grondwater de presentatie van een hoog niveau van nitraten getoond.
Detectie van virussen in een laag of matig vervuild water vereist dat de concentratie van de virussen uit ten minste een aantal liter water in een veel kleiner volume, een procedure die gewoonlijk bestaat uit twee stappen concentratie in serie. Deze ietwat omslachtige procedure en de variabiliteit waargenomen in virale terugvorderingen aanzienlijke mate zullen belemmeren gelijktijdige verwerking van een groot aantal watermonsters.
Om het knelpunt veroorzaakt door de twee voor-stap procedures die we hebben toegepast een een-stap protocol ontwikkeld in de vorige Studie te eliminerens en van toepassing zijn op een diversiteit aan water matrices. De procedure bestaat uit: verzuring van de tien-liter watermonsters, uitvlokking door magere melk, de zwaartekracht sedimentatie van de geflocculeerd materialen, de inning van de neerslag en centrifugeren, resuspensie van de neerslag in 10 ml fosfaatbuffer. De virale concentraat wordt gebruikt voor de winning van virale nucleïnezuren en de specifieke adenovirussen en polyomavirussen van belang zijn gekwantificeerd door qPCR. Groot aantal monsters kan tegelijkertijd worden geanalyseerd met deze low-cost concentratie-methode.
De procedure is toegepast op de analyse van het zwemwater, zeewater en rivierwater en in deze studie, presenteren wij de resultaten analyseren van grondwatermonsters. Deze high-throughput kwantitatieve methode is betrouwbaar, eenvoudig en kosteneffectief.
Protocol
1. De concentratie van de virale deeltjes in het water monsters
- Verzamelen en conditioneren van watermonsters
- Verzamel een minimum van 2 herhalingen van 10 L per monster in plastic containers met vlakke bodem en een extra monster als een proces controle. Dit laatste monster wordt verrijkt met een bekende hoeveelheid van virale deeltjes en gebruikt als een controle.
Opmerking: Het is aan te raden om speciale aparte materiaal (flessen, buizen, enz.) voor spiked samples hebben. - Controleer de kalibratie van de conductimeter en indien nodig opnieuw kalibreren. Bereid een negatieve controle met behulp van leidingwater eerder aangepast aan de goede geleidbaarheid (zie hieronder 1.6) in een extra plastic 10 L container.
- Voor spiked samples: Voeg de standaard volume van de controle-virus (ongeveer 10 5 exemplaren van het genoom per 10 L water) aan het monster. Meng door roeren te vermijden spatten en aërosolen. Positieve controles zou kunnen bestaan in een ongewone stam van adenovirus such als HAdV-35 of een bacteriofaag, zoals MS2.
- Als het monster presenteert grote hoeveelheid gesuspendeerd materiaal (zand of andere materialen), sediment laat het gedurende 15 minuten. Breng het water in een nieuwe container.
- Breng de pH van het watermonster tot 3,5 (± 0,1) door de toevoeging van 1 N HCl. Deze stap is belangrijk voor de concentratie van de virussen, dus zorg ervoor dat de pH-waarde goed is afgesteld. Meng de water door krachtig roeren tijdens het toevoegen van de HCl. (Opmerking: als de pH lager is dan 3,5 toe te voegen 1 M NaOH).
- Stel de geleidbaarheid. Indien het monster heeft een geleidbaarheid van 1500 mS / cm of hoger, is deze stap niet nodig. Als de geleidbaarheid lager is dan 1500 mS / cm de vorming van uitgevlokt materiaal (vlokken) is niet gegarandeerd zo aan te passen de geleidbaarheid tot 1500 mS / cm door de toevoeging van kunstmatige zeezout (Sigma). Meng krachtig door te roeren tijdens het toevoegen van de zee zouten.
- Noteer de pH van de monsters voor en na conditionering ook eens het volume van HCl gebruikt. De geleidbaarheid moet ook worden opgenomen na het instellen van de pH. Altijd de pH-meter en conductimeter elektroden desinfecteren met een frisse HCl-oplossing, dechlorinate met 10% natrium tiosulphate oplossing en tenslotte spoelen met gedistilleerd water.
- Verzamel een minimum van 2 herhalingen van 10 L per monster in plastic containers met vlakke bodem en een extra monster als een proces controle. Dit laatste monster wordt verrijkt met een bekende hoeveelheid van virale deeltjes en gebruikt als een controle.
- Voorbereiding van de pre-uitgevlokt 1% afgeroomde melk (PSM)
- Controleer de kalibratie van de pH-meter en de conductimeter en indien nodig opnieuw kalibreren.
- Bereid pre-uitgevlokt magere melk-oplossing (1% PSM, w / v) door het oplossen van 10 g magere melkpoeder (Difco) in een L kunstmatig zeewater (ontbinden 33,3 g van kunstmatige zeezout in een L van chloorvrij leidingwater en autoclaaf) en zorgvuldig het instellen van de pH op 3,5 met 1 N HCl. De vlokken zichtbaar moet zijn. Bereid de oplossing vlak voor het te gebruiken of op te slaan bij 4 ° C gedurende 24 uur Voor dechlorering gebruik 1 ml van 10% tiosulphate oplossing per 100 ml water.
- Uitvlokking van virale deeltjes in het water monsters
- Voeg 100 ml van 1% PSM aan de 10-L watermonster.
- Roer de monsters voor 8-10 uur, zodat de virussen tot adsorptie aan de vlokken. Gebruik een timer om uitschakeling van de roeren na 8-10 uur
- Stop de roeren en laat de vlokken sediment door de zwaartekracht voor 8-10 uur
- Het verzamelen en opnieuw ontbinding van de vlokken. Centrifugeren
- Verwijder de bovenstaande vloeistof met behulp van een peristaltische pomp en een plastic pipet verbonden met een plastic buis. Voor spiked samples van de supernatant moet worden verzameld in een fles en gedesinfecteerd volgens de interne procedures. In alle gevallen TAKE CARE niet op de korrel te verzamelen.
- Verzamel het sediment met de vlokken (ongeveer 500 ml) in een centrifuge fles.
- De balans van de potten door de toevoeging van PSM pH 3,5.
- Centrifugeer de potten in een high-speed centrifuge bij 8000 xg gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Zodra de centrifuge stopt, verwijder voorzichtig de centrifuge potten uit de centrifuge.
- Zeer gently giet af en gooi het supernatant. Volg de passende maatregelen voor besmettelijke materiaal.
- Voeg 7 ml fosfaatbuffer om de pellet te lossen in elke centrifuge fles.
- Zodra de vlokken zijn opgelost, meten en voeg fosfaatbuffer tot een totaal volume van 10 ml te bereiken.
- Homogeniseren van de virale concentreren door vortexen en de 10 ml in schoon microbuisjes die moet worden bevroren bij -80 ° C te verdelen totdat het nodig is in de verdere analyse.
2. Nucleïnezuur-extractie
- Voer een nucleïnezuur extractie met de QIAamp Viral RNA Mini Kit na instructies van de fabrikant. Deze kit maakt het gebruik van een geautomatiseerd platform (zoals Qiacube, Qiagen).
3. Kwantitatieve PCR van de menselijke adenovirussen (HAdV), JC polyomavirussen (JCPyV), varkens adenovirussen (PAdV) en runderen polyomavirussen (BPYV)
- Kwantificering van de exemplaren van het genoom in de monsters
- Bereidende qPCR mix in een schone aparte ruimte met behulp van TaqMan PCR Master Mix Environmental 2x (Applied Biosystems). De reactie vindt plaats in een 96-well optische reactie plaat bedekt met optische lijm covers. Concentraties van de Master Mix, zijn primers en probes beschreven in tabel 1.
- Zodra de mix is opgesteld, hoeveelheid 15μl in elk putje inbegrip van de controles (zie 3.2). Het totale volume voor een reactie na toevoeging van een zal worden 25μl (15μl mix + 10μl monster of standaard).
- Voeg de nucleïnezuur extracties uit de monsters (10μl) in een aparte ruimte. Lopen directe en een tien-voudige verdunning in gezuiverd water van elk monster in tweevoud. Bedek de putjes die de monsters met een deel van een zelfklevende plastic, houd het andere deel van de dekking voor de volgende stap.
- Voeg verdunningen van het DNA standaard suspensies (10μl) van 10 0 tot 10 6 GC/10μl door drievoud en het gebruik van een micropipet uitsluitend gebruikt voor het standaard DNA. Het is raadzaam om de normen toe te voegen in een ruimte die is uitgerust met UV-straling voor de vernietiging van plasmide DNA en de micropipet schoon na elk gebruik. Bedek de putjes die de normen met de pre-cut lijm te dekken.
Opmerking: Om standaard suspensies worden gebruikt in de kwantificering van exemplaren van het genoom voor te bereiden, moet de doel-DNA regio worden gekloneerd in een plasmide en linearisering. In het volgende adres vindt u een gedetailleerde procedure over de wijze waarop standaard curves maken met plasmide DNA templates om te worden gebruikt in qPCR:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Voer de qPCR in een adequaat systeem selecteren van de juiste parameters (gezien het gebruik van lijm te dekken en het totale volume in elk putje, etc). Na activering van de AmpliTaq Goud voor 10 min bij 95 ° C, 40 cycli van amplificatie worden als volgt uitgevoerd: 15 s bij 95 ° Cen 1 min bij 60 ° C voor HAdV, JCPyV en BPYV, en 15 s bij 95 ° C, 20s bij 55 ° C en 20s op 60 ° C voor PAdV.
- Zodra de reacties zijn voltooid, slaat gegevens en resultaten, zoals beschreven in de gebruiksaanwijzing van de apparatuur gebruikt. De hoeveelheid DNA zal worden gedefinieerd als de mediaan van de gegevens verkregen na het corrigeren van de verdunningsfactor als dat nodig is.
- Controls
- Gebruik positieve en negatieve controles. De test moet meer dan een niet-template control (NTC) om te bewijzen mix niet fluorescentie te produceren. Het is raadzaam om het positieve proces controle uitgevoerd in om potentiële enzymatische remming door remmers aanwezig zijn in de onderzochte monsters te evalueren.
- Noteer de resultaten van qPCR testen van twee verschillende verdunningen van de standaard-DNA en uit het proces te controleren. Gebruik de resultaten om de controle charts voor te bereiden op de kwaliteitscontrole (QC) programma's die verband houden met de gevoeligheid en de efficiëntie van de testen.
- Bevestiging van deresultaten
- Positieve resultaten kan verder worden bevestigd met behulp van geneste-PCR en sequentieanalyse van de amplicons, het produceren van aanvullende gegevens over de nucleotidesequenties van de stammen gevonden 1,5,6,7,9,12.
Na de procedure beschreven, hebben menselijke en dierlijke virussen gedetecteerd en gekwantificeerd in zwemwater, zeewater en rivierwater 2,3. Als een representatief voorbeeld, werden grondwater monsters van de lokalen met een hoog nitraatgehalte geëvalueerd om de bronnen van de verontreiniging te bepalen. Tien liter water monsters werden verzameld uit vier verschillende putten in de landelijke gebieden van een noordoostelijke regio in Spanje. Vijf repliceert werden verzameld in ieder welzijn een repliceren bezaaid met menselijke adenovirus 2 gebruikt als process control. Monsters werden behandeld volgens het protocol weergegeven in Figuur 1. De vier repliceert geanalyseerd in een van de bestudeerde vier locaties toonden positieve resultaten voor PAdV (gemiddelde waarde 7,74x10 2 GC / L) die verband houden met de aanwezigheid van varken slurries in de gebieden rondom de bemonstering plaats en zou fecale verontreiniging van varkens als de bron van nitraten in het grondwater (tabel 2) te ondersteunen.
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Procedure voor de detectie en kwantificering van virussen in het water.
Tabel 1. Concentratie van primers en probes voor qPCR assays.
Tabel 2. Detectie en kwantificering van de dierlijke en menselijke adenovirussen en polyomavirussen in het grondwater monsters.
n aantal herhalingen geanalyseerde
% Percentage positieve repliceert
(-) Niet gedetecteerd
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven procedure zou voldoen aan de voorwaarden voor een passende methode voor routinematige milieu en volksgezondheid laboratoria: reproduceerbaar, betrouwbaar, eenvoudig en kosteneffectief. Het protocol is eenvoudig, maar het moet zorgvuldig worden gevolgd. Lage geleidbaarheid in de monsters zonder toevoeging van de gevraagde concentratie van kunstmatig zeewater zouten zou drastisch verminderen van het herstel van virussen zoals het geval zou zijn indien het roeren tijd voor flocculatie wordt aanzienlijk verminderd (minder dan 5 uur bijvoorbeeld).
Momenteel worden toegepast MST tools zijn over het algemeen op basis van moleculaire technieken. Studies ontwikkeld door verschillende groepen hebben laten zien dat van de momenteel gebruikte parameters (dwz bacteriële genen) geen enkele is zo specifiek als nodig is. Dus het gebruik van een combinatie van deze parameters is voorgesteld als de beste benadering voor een efficiënte opvolging van de oorsprong van de fecale verontreiniging in waterlichamen 8,11.
jove_content "> In de afgelopen jaren heeft de studie van de gekozen DNA-virussen die produceren in veel gevallen hardnekkige infecties in afwezigheid van klinische symptomen, zich ontpopt als een methode voor het bron-tracking fecale verontreiniging in het milieu. kwantitatieve PCR-technieken en de voorgenomen concentratie methode betrouwbare waarden van de concentratie van deze virussen en zeer waardevolle gegevens voor de ontwikkeling van risico-assessment studies en herstel acties. Deze technieken zijn ook zeer gevoelig en specifiek, dat is een absolute voorwaarde voor het volgen van de bron van verontreiniging. Ook zullen zij een zeer nuttig hulpmiddel voor het genereren van grotere databases voor de kwantitatieve karakterisering van de uitscheiding en de verspreiding van de specifieke virussen voorgesteld als microbiële source-tracking tools in diverse geografische gebieden.De beschreven procedure maakt de analyse van veelvoudige monsters tegelijk in ongeveer 48 uur zonder intensieve arbeidsbehoeftes. De beschikbaarheid van een efficiënte low-cost concentratie methode ondersteuning van de toepasbaarheid van HAdV en JCPyV, en PAdV en BPYV in het water zo kosteneffectief assays voor kwantitatieve microbiële bron-tracking studies en de identificatie van de oorsprong van verontreinigingen in het grondwater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Twee octrooi-aanvragen werden ingediend in 2009 tot de intellectuele eigendom van protocollen te beschermen voor de kwantificering van PAdV en BPYV.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Spaanse regering "Ministerio de Educación y Ciencia" (project AGL2008-05275-C01/ALI), door de Europese Unie kaderprogramma 7 gefinancierde projecten VIROBATHE (Contract No 513648), VIROCLIME (Contract Nr 243923 ) en door de Catalaanse agentschap van het Water, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Control I Millora dels Ecosistemes Aquatics. Tijdens de studie ontwikkelde Marta Rusiñol was een fellow van de Catalaanse regering "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
