Summary
Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode für die Identifizierung der Quelle der fäkale / Urin Kontamination oder Verunreinigung durch Nitrat in Wasser mittels qPCR für die spezifische Quantifizierung von Mensch / Schwein / Rind DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren als MST-Tools vorgeschlagen.
Abstract
Mikrobielle Kontamination der Umwelt stellt eine erhebliche Gesundheitsgefahr. Klassische bakterielle fäkalen Indikatoren haben gezeigt, dass erhebliche Einschränkungen haben, sind Viren resistenter gegen viele Inaktivierung Prozesse und Standards fäkalen Indikatoren nicht auf die Quelle der Verunreinigung zu informieren. Die Entwicklung von kosteneffizienten Methoden für die Konzentration der Viren aus dem Wasser und molekularen Assays ermöglicht die Anwendbarkeit von Viren als Indikatoren für fäkale Verunreinigungen und mikrobiellen Quelle Tracking (MST)-Tools. Adenoviren und Polyomaviren sind DNA-Viren infizieren bestimmten Wirbeltierarten einschließlich des Menschen und werden dauerhaft in Kot und / oder Urin in allen geografischen Gebieten studiert ausgeschieden. In früheren Studien, schlugen wir die Quantifizierung von humanen Adenoviren (HAdV) und JC Polyomaviren (JCPyV) durch quantitative PCR (qPCR) als Index für die menschliche fäkale Verunreinigungen. Vor kurzem haben wir qPCR-Assays für die spezifische Quantifizierung von por entwickeltcine Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV) als tierische Fäkalien Marker der Kontamination mit Empfindlichkeiten von 1-10 Genom Kopien pro Reagenzglas. In dieser Studie stellen wir die Verfahren, nach dem die Quelle der Kontamination in Wasserproben mit diesen Tools zu identifizieren. Als Beispiel für repräsentative Ergebnisse, ist die Analyse der Viren im Grundwasser stellt ein hohes Maß an Nitraten gezeigt.
Nachweis von Viren in niedrig oder mäßig verschmutztes Wasser erfordert die Konzentration der Viren von mindestens mehrere Liter Wasser in einem viel kleineren Volumen, ein Verfahren, das in der Regel umfasst zwei Schritte Konzentration in Serie. Diese etwas umständliche Prozedur und die Variabilität der viralen Erholungen zu beobachten wesentlich erschweren die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Wasserproben.
Zur Beseitigung des Engpasses durch die Zwei-Schritt-Verfahren verursacht haben wir in einem Schritt-Protokoll in den vergangenen studie entwickelt beantragt haben,s und für eine Vielfalt von Wasser-Matrizen. Das Verfahren umfasst: Versauerung der Zehn-Liter-Wasser-Proben, Flockung von Magermilch, Schwerkraftsedimentation der geflockten Materialien, Sammlung des Niederschlags und Zentrifugation, Resuspension des Niederschlags in 10 ml Phosphat-Puffer. Die virale Konzentrat wird für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren und die spezifischen Adenoviren und Polyomaviren von Interesse sind, durch qPCR quantifiziert werden. Hohe Anzahl von Proben können gleichzeitig analysiert werden mit dieser Low-Cost-Konzentration Methode.
Das Verfahren ist auf die Analyse von Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser angewendet, und bei dieser Studie präsentieren wir Ergebnisse der Analyse Grundwasserproben. Diese High-Throughput-quantitative Methode ist zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig.
Protocol
1. Die Konzentration der viralen Partikel in Wasserproben
- Sammlung und Aufbereitung von Wässern
- Sammeln Sie mindestens 2 Wiederholungen von 10 L pro Probe in Kunststoff-Behälter mit flachem Boden und einer zusätzlichen Probe als einen Prozess zu steuern. Diese letzte Probe wird mit einer bekannten Menge von Viruspartikeln versetzt werden und als eine Kontrolle.
Hinweis: Es wird empfohlen, spezielle getrennte Material (Flaschen, Rohre, etc.) für die aufgestockten Proben haben. - Überprüfen Sie die Kalibrierung des Leitfähigkeitsmesser und neu kalibrieren, wenn nötig. Bereiten Sie eine negative Kontrolle mit Leitungswasser vorher auf die ausreichende Leitfähigkeit eingestellt (siehe unten 1.6) in einem extra Kunststoff 10 l-Behälter.
- Für dotierten Proben: Fügen Sie die Standard-Lautstärke der Kontrolle Virus (ca. 10 5 Genomkopien pro 10 l Wasser) auf die Probe. Mix durch Rühren vermeiden Spritzer und Aerosole. Positive Kontrollen könnten in einer ungewöhnlichen Belastung von Adenovirus s bestehenuch als HAdV-35 oder einem Bakteriophagen wie MS2.
- Wenn die Probe stellt hohe Menge an suspendiertem Material (Sand oder anderen Materialien), lassen Sie es Sediment für 15 Minuten. Übertragen Sie die Wasser in einen neuen Container.
- Den pH-Wert der Wasserprobe auf 3,5 (± 0,1) durch die Zugabe von 1 N HCl. Dieser Schritt ist für die Konzentration der Viren wichtig, so stellen Sie sicher, dass der pH-Wert wurde richtig eingestellt. Mix das Wasser gründlich durch kräftiges Rühren unter Zugabe der HCl. (Hinweis: Wenn der pH-Wert niedriger als 3,5 add 1 M NaOH).
- Passen Sie die Leitfähigkeit. Wenn die Probe hat eine Leitfähigkeit von 1500 S / cm oder höher, ist dieser Schritt nicht erforderlich. Ist die Leitfähigkeit niedriger als 1500 S / cm die Bildung von ausgeflockte Material (Flocken) ist nicht garantiert, so stellen Sie die Leitfähigkeit bis 1500 S / cm durch den Zusatz von künstlichen See Salze (Sigma). Kräftig mischen, unter Rühren unter Zugabe von Meer-Salze.
- Notieren Sie den pH-Wert der Proben vor und nach der Konditionierung als gut eins das Volumen der HCl verwendet. Die Leitfähigkeit sollte auch nach Einstellung des pH aufgezeichnet werden. Immer desinfizieren das pH-Meter und Konduktometer Elektroden mit einem frischen HCl-Lösung, mit 10% iger Lösung tiosulphate entchloren und schließlich mit destilliertem Wasser spülen.
- Sammeln Sie mindestens 2 Wiederholungen von 10 L pro Probe in Kunststoff-Behälter mit flachem Boden und einer zusätzlichen Probe als einen Prozess zu steuern. Diese letzte Probe wird mit einer bekannten Menge von Viruspartikeln versetzt werden und als eine Kontrolle.
- Vorbereitung der Vor-geflockt 1% Magermilch (PSM)
- Überprüfen Sie die Kalibrierung des pH-Meter und die Konduktometer und neu kalibrieren, wenn nötig.
- Bereiten Sie vor ausgeflockt Magermilch-Lösung (1% PSM, w / v) durch Auflösen von 10 g Magermilchpulver (Difco) in 1 L künstlichem Meerwasser (Auflösung 33,3 g künstliche Meersalz in 1 l entchlortem Leitungswasser und Autoklaven) und sorgfältig der pH-Wert auf 3,5 mit 1N HCl. Die Flocken sichtbar sein soll. Bereiten Sie die Lösung kurz vor verwendet werden soll oder lagern bei 4 ° C für 24 h Für Dechlorierung Verwendung von 1 ml 10% tiosulphate Lösung pro 100 ml Wasser.
- Flockung von Viruspartikeln in Wasserproben
- Add 100 ml von 1% PSM auf die 10-L Wasserprobe.
- Rühren Sie die Proben für 8-10 h, damit die Viren an die Flocken zu adsorbieren. Verwenden Sie einen Timer zum Abschalten des Rührens nach 8-10 h.
- Stoppen Sie das Rühren und lassen Sie die Flocken Sediment durch die Schwerkraft für 8-10 h.
- Das Sammeln und wieder Lösen der Flocken. Zentrifugation
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Schlauchpumpe und einer Kunststoff-Pipette verbunden mit einem Kunststoffrohr. Für dotierten Proben der Überstand sollte in eine Flasche gesammelt und desinfiziert werden nach internen Verfahren. In allen Fällen darauf achten, nicht auf das Pellet zu sammeln.
- Sammeln Sie die Sedimente mit den Flocken (ca. 500 ml) in einer Zentrifuge Flasche.
- Gleichen Sie die Töpfe durch die Zugabe von PSM pH 3,5.
- Zentrifugieren Sie die Töpfe in einen Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge bei 8.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Sobald die Zentrifuge stoppt, entfernen Sie vorsichtig die Zentrifuge Töpfe aus der Zentrifuge.
- Sehr gently abgießen und den Überstand verwerfen. Folgen Sie geeignete Maßnahmen zur infektiösem Material.
- Add 7 ml Phosphatpuffer, um das Pellet in jede Zentrifuge Flasche zu lösen.
- Nachdem die Flocken aufgelöst haben, messen und fügen Phosphatpuffer auf ein Gesamtvolumen von 10 ml zu erreichen.
- Homogenisieren der viralen Konzentrat durch Vortexen und verteilen die 10 ml in ein sauberes Röhrchen, die bei -80 ° C sollte bis zum Gebrauch in die weitere Analyse.
2. Nukleinsäure-Extraktion
- Führen Sie eine Nukleinsäure-Extraktion mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Dieses Kit ermöglicht die Verwendung eines automatisierten Plattform (wie QIAcube, Qiagen).
3. Quantitative PCR von humanen Adenoviren (HAdV), JC Polyomaviren (JCPyV), Schwein Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV)
- Die Quantifizierung der Genom-Kopien in den Proben
- Vorbereitender qPCR Mix in einem sauberen separaten Bereich mit TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Die Reaktion findet in einem 96-Loch-optische Reaktion Platte mit optischer Kleber abdeckt. Die Konzentrationen der Master Mix, sind Primer und Sonden in Tabelle 1 beschrieben.
- Sobald die Mischung hergestellt wurde, aliquoten 15μl in jede Vertiefung, einschließlich der Kontrollen (siehe 3.2). Das Gesamtvolumen für eine Reaktion nach Zugabe von Ziel wird es sein 25 &mgr; l (15μl Mix + 10 &mgr; l Probe oder Standard).
- Fügen Sie die Nukleinsäure-Extraktionen aus den Proben (10 &mgr; l) in einem separaten Bereich. Run direkte und eine zehnfache Verdünnung in gereinigtem Wasser von jeder Probe in zweifacher Ausfertigung. Decken Sie die Vertiefungen mit den Proben mit einem Teil eines Klebstoffes decken, halten die anderen Teil der Abdeckung für den folgenden Schritt.
- Add Verdünnungen der DNA-Standard-Suspensionen (10 &mgr; l) von 10 0 bis 10 6 GC/10μl von dreifacher Ausfertigung und mit einer Mikropipette ausschließlich für den stan verwendetdard-DNA. Es ist ratsam, die Standards in einem Gebiet mit UV-Strahlung für die Zerstörung Plasmid-DNA und der Mikropipette nach jedem Gebrauch gereinigt ausgestattet hinzuzufügen. Decken Sie die Vertiefungen mit den Standards der pre-cut Klebstoff zu decken.
Hinweis: Um Standard-Suspensionen in der Quantifizierung der Genom-Kopien verwendet werden vorbereitet, sollte der Ziel-DNA Region in ein Plasmid und linearisierte geklont werden. In der folgenden Adresse finden Sie eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens, wie man Standard-Kurven mit Plasmid-DNA-Templates in qPCR eingesetzt werden zu erstellen:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Führen Sie die qPCR in ein angemessenes System der Auswahl der geeigneten Parameter (unter Berücksichtigung der Verwendung von Klebstoff Abdeckung und das Gesamtvolumen in jede Vertiefung, etc). Nach der Aktivierung der AmpliTaq Gold für 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen der Amplifikation sind wie folgt durchgeführt: 15 s bei 95 ° Cund 1 min bei 60 ° C für HAdV, JCPyV und BPyV und 15 s bei 95 ° C, 20s bei 55 ° C und 20s bei 60 ° C für PAdV.
- Sobald die Reaktionen abgeschlossen sind, verwendet Daten speichern und die Ergebnisse wie in der Bedienungsanleitung des Gerätes beschrieben. Die DNA-Menge wird als der Median der Daten nach der Korrektur der Verdünnungsfaktor bei Bedarf erhalten definiert werden.
- Steuerung
- Verwenden Sie positive und negative Kontrollen. Der Test muss mehr als eine Nicht-Template (NTC) zu beweisen, Mix produziert keine Fluoreszenz. Es ist ratsam, den positiven Prozess-Steuerung laufen lassen, um mögliche enzymatische Hemmung durch Inhibitoren, die in den untersuchten Proben zu bewerten.
- Rekordergebnis von qPCR-Assays von zwei verschiedenen Verdünnungen der Standard-DNA und von der Prozess-Steuerung. Verwenden Ergebnisse Regelkarten für die Qualitätskontrolle (QC)-Programme im Zusammenhang mit der Sensitivität und Effizienz des Tests vorzubereiten.
- Bestätigung derErgebnisse
- Positive Ergebnisse können weiter bestätigt werden mittels nested-PCR-und Nukleotid-Sequenzierung der Amplifikate, produziert zusätzliche Daten über die Nukleotidsequenzen der Stämme nachgewiesen 1,5,6,7,9,12.
Nach der beschriebenen Vorgehensweise haben menschlichen und tierischen Viren nachgewiesen und quantifiziert in Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser 2,3. Als repräsentatives Beispiel wurden Grundwasserproben aus den Bereichen präsentiert ein hohes Maß an Nitraten ausgewertet, um die Quellen der Verunreinigungen zu definieren. Zehn-Liter-Wasser-Proben wurden aus 4 verschiedenen Brunnen in ländlichen Gebieten der Nordost-Region in Spanien gesammelt. Fünf Wiederholungen wurden in jede Vertiefung wird ein Replikat mit humanen Adenovirus 2 als Prozesskontrolle eingesetzt ausgesät gesammelt. Die Proben wurden nach dem Protokoll in Abbildung 1 dargestellt verarbeitet. Die vier Wiederholungen analysiert in einem der vier Standorte untersucht zeigten positive Ergebnisse für PAdV (Mittelwert 7,74x10 2 GC / L), die auf das Vorhandensein von Schweine-Schlämmen in den Bereichen rund um die Probenahme vor Ort bezogen sein würde und würde fäkale Kontamination Schweine als Quelle von Nitraten in das Grundwasser (Tabelle 2) zu unterstützen.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von Viren im Wasser.
Tabelle 1. Konzentration der Primer und Sonden für die qPCR-Assays.
Tabelle 2. Erkennung und Quantifizierung von tierischen und menschlichen Adenoviren und Polyomaviren in Grundwasserproben.
n Anzahl der Wiederholungen analysiert
% Anteil der positiven repliziert
(-) Nicht erkannt
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Discussion
Die beschriebene Vorgehensweise würde die Voraussetzungen für eine passende Methode für den Routineeinsatz Umwelt und öffentliche Gesundheit Laboratorien: reproduzierbar, zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig. Das Protokoll ist einfach, aber es müssen unbedingt beachtet werden. Niedrige Leitfähigkeit in den Proben ohne Zugabe von der angeforderten Konzentration von künstlichem Meerwasser Salze würden drastisch reduzieren die Wiederherstellung von Viren wie der Fall wäre, wenn die Rührzeit zur Flockung deutlich reduziert wird (weniger als 5 Stunden zum Beispiel).
Derzeit angewendet MST-Tools sind in der Regel auf molekularer Techniken. Studien von verschiedenen Gruppen entwickelt haben gezeigt, dass von den derzeit verwendeten Parameter (dh bakterieller Gene) keine so spezifisch ist, wie gebraucht. So ist die Verwendung einer Kombination dieser Parameter wurde als die beste Annäherung für eine effiziente Verfolgung der Herkunft der fäkale Verunreinigungen in Gewässern 8,11 vorgeschlagen worden.
jove_content "> In den letzten Jahren hat die Untersuchung der ausgewählten DNA-Viren, die in vielen Fällen produzieren persistierende Infektionen in Abwesenheit von klinischen Symptomen, wie eine Methode zur Quelle-Tracking fäkale Verunreinigungen in der Umwelt entstanden. Quantitative PCR-Techniken und die Konzentration vorgeschlagene Methode zuverlässige Werte der Konzentration dieser Viren und sehr wertvolle Daten für die Entwicklung von Risiko-Assessment-Studien und Korrekturmaßnahmen. Diese Techniken sind auch sehr sensitive und spezifische, die ist eine absolute Voraussetzung für die Verfolgung der Quelle der Verunreinigung. Außerdem werden sie ein sehr nützliches Werkzeug für die Erzeugung von größeren Datenbanken für die quantitative Charakterisierung der Ausscheidung und die Verbreitung von spezifischen Viren als mikrobiellen Quelle-Tracking-Tools in unterschiedlichen geographischen Gebieten vorgeschlagen.Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig in ca. 48 Stunden ohne intensive Arbeitsaufwands. Die Verfügbarkeit einer leistungsfähigen Low-Cost-Konzentration Methode unterstützen die Anwendbarkeit von HAdV und JCPyV und PAdV und BPyV in Wasser als kostengünstige Assays zur quantitativen mikrobiellen Quelle-Tracking-Studien und die Identifizierung der Herkunft von Schadstoffen in das Grundwasser.
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Disclosures
Zwei Patentanmeldungen wurden 2009 eingereicht, um das geistige Eigentum von Protokollen für die Quantifizierung der PAdV und BPyV schützen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von der spanischen Regierung "Ministerio de Educación y Ciencia" (Projekt AGL2008-05275-C01/ALI) unterstützt, die von der Europäischen Union im 7. Rahmenprogramm Forschung geförderten Projekten VIROBATHE (Contract No 513648), VIROCLIME (Contract No 243923 ) und durch die Katalanische Agentur für Wasserwirtschaft, Agència Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Control i Millora dels Ecosistemes Wassersport. Während die entwickelten Studie Marta Rusiñol war Stipendiat der katalanischen Regierung "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
