Summary
המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.
Abstract
זיהום מיקרוביאלית של הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי. קלאסי אינדיקטורים צואתי חיידקי הראו שיש מגבלות משמעותיות, וירוסים הם עמידים יותר בפני תהליכי איון הרבה אינדיקטורים צואה רגילה לא להודיע על מקור הזיהום. פיתוח חסכונית שיטות ריכוז של וירוסים ממים מבחני מולקולרית מקלה את הישימות של וירוסים כאינדיקטורים לזיהום צואתי ו חיידקים כמו מעקב אחר המקור (MST) כלים. Adenoviruses ו polyomaviruses הם נגיפי DNA מדביק בעלי החוליות כולל בני אדם ספציפיים, ומופרשים בצואה בהתמדה ו / או שתן בכל האזורים הגיאוגרפיים למד. במחקרים קודמים, הצענו כימות adenoviruses האנושי (HAdV) ו polyomaviruses JC (JCPyV) על ידי ה-PCR כמותי (qPCR) כאינדקס של זיהום צואתי אנושי. לאחרונה, פיתחנו מבחני qPCR עבור כימות מסוים של porcine adenoviruses (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV) כסמנים של זיהום צואתי חיה עם רגישויות של עותקים בגנום 1-10 לכל מבחנה. במחקר זה, אנו מציגים את והנוהל לזהות את מקור הזיהום בדגימות מים באמצעות כלים אלה. כדוגמה נציג של תוצאות, ניתוח של וירוסים במים הקרקע הצגת רמות גבוהות של חנקות מוצג.
איתור של וירוסים במים מזוהמים נמוך או בינוני דורש ריכוז של וירוסים מ לפחות כמה ליטרים של מים לתוך נפח קטן בהרבה, הליך שבדרך כלל כולל שני שלבים ריכוז בסדרה. זו פרוצדורה מסורבלת במקצת ואת השתנות נצפתה החלמה ויראלי משמעותי בסל עיבוד בו זמני של מספר גדול של דגימות המים.
על מנת למנוע את צוואר הבקבוק נגרמת על ידי שני שלבים נהלים יישמנו פרוטוקול צעד אחד שפותח studie הקודםs ו החלים על מגוון של מטריצות מים. ההליך כולל: החמצה של עשרה ליטר דגימות מים, הפתתה על ידי חלב דל שומן, שקיעה הכובד של חומרי flocculated, אוסף של המשקע ו צנטריפוגה, resuspension של המשקע במאגר פוספט 10 מ"ל. להתרכז ויראלי משמש להפקת חומצות גרעין ויראליות ואת adenoviruses ספציפיים polyomaviruses של הריבית על ידי לכמת qPCR. מספר גבוה של דגימות עשוי להיות מנותח בו זמנית בשיטה זו עלות נמוכה ריכוז.
הנוהל הוחל על ניתוח של מי ים, מי ים ומים הנהר במחקר זה, אנו מציגים תוצאות ניתוח דגימות מי התהום. שיטה זו תפוקה גבוהה כמותי אמין, פשוט, וחסכוני.
Protocol
1. ריכוז של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים
- אוסף ומיזוג של דגימות מים
- איסוף מינימום של 2 משכפל של L 10 לדגימה במכלי פלסטיק עם תחתית שטוחה דגימה אחת נוספת כמו בקרת תהליך. מדגם זה האחרון יהיה ממוסמר עם כמות ידועה של חלקיקים נגיפיים לשמש מלאה.
הערה: מומלץ יש חומר מיוחד נפרד (בקבוקים, צינור וכו ') עבור דגימות ממוסמר. - בדיקת כיול של conductimeter ו לכייל מחדש במידת הצורך. הכן בקרה שלילית על ידי שימוש במי ברז מותאם בעבר מוליכות מספיק (ראה להלן 1.6) באחד מיכל פלסטיק תוספת 10 L.
- לקבלת דוגמיות ממוסמר: הוסף נפח סטנדרטי של הנגיף השליטה (כ -10 5 עותקים בגנום לכל 10 ליטר מים) המדגם. מערבבים מתיזים על ידי ערבוב הימנעות ו אירוסולים. שולטת חיובי יכול להכיל בזן נדיר של adenovirus such כמו HAdV-35 או bacteriophage כגון MS2.
- אם המדגם מציג כמות גבוהה של חומר מושעה (חול או חומרים אחרים), תן לו משקעים במשך 15 דקות. מעבירים את המים לתוך מיכל חדש.
- התאם את ה-pH של המדגם מים 3.5 (± 0.1) על ידי תוספת של 1 N HCl. שלב זה חשוב לצורך ריכוז של וירוסים, כדי לוודא את רמת החומציות הותאם כראוי. מערבבים את המים באופן יסודי על ידי בחישה נמרצת תוך הוספת HCl. (הערה: אם רמת ה-pH נמוך מ 3.5 להוסיף 1 M NaOH).
- התאם את המוליכות. אם המדגם יש המוליכות של 1500 μS / ס"מ ומעלה, שלב זה אינו נחוץ. אם מוליכות נמוכה מ 1500 μS / cm היווצרות חומר flocculated (flocs) אינו מובטח כך להתאים את מוליכות אל μS 1500 / cm על ידי תוספת של מלחי ים מלאכותי (Sigma). מערבבים נמרצות על ידי ערבוב תוך הוספת מלחי הים.
- שיא ה-pH של דגימות לפני ואחרי מיזוג כמו גםs נפח HCl בשימוש. מוליכות צריך גם להיות מוקלט לאחר התאמת ה-pH. תמיד לחטא את ה-pH-מטר conductimeter האלקטרודות בתמיסת HCl טריים, טיהרת עם פתרון של 10% tiosulphate נתרן ולבסוף לשטוף עם מים מזוקקים.
- איסוף מינימום של 2 משכפל של L 10 לדגימה במכלי פלסטיק עם תחתית שטוחה דגימה אחת נוספת כמו בקרת תהליך. מדגם זה האחרון יהיה ממוסמר עם כמות ידועה של חלקיקים נגיפיים לשמש מלאה.
- הכנת חלב מראש flocculated רזה 1% (PSM)
- בדוק את כיול מכשירי pH meter לבין conductimeter ו לכייל מחדש במידת הצורך.
- הכן מראש flocculated פתרון חלב דל שומן (1% PSM, w / v) על ידי המסת 10 גרם אבקת חלב דל שומן (Difco) ב 1 ליטר מי ים מלאכותי (להמיס 33.3 גרם של מלחי ים מלאכותי L 1 של מי ברז החיטוי dechlorinated ו) ו בקפידה כדי להתאים את ה-pH 3.5 עם HCl 1N. Flocs צריך להיות גלוי. הכן את הפתרון ממש לפני לשמש או לאחסן ב 4 ° C למשך 24 ח עבור dechlorination להשתמש 1 מ"ל של תמיסת tiosulphate 10% 100 מ"ל מים.
- הפתתה של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים
- מוסיפים 100 מ"ל של PSM 1% ל מדגם 10-L המים.
- מערבבים את דגימות עבור 8-10 שעות, כדי לאפשר וירוסים כדי לספוג את flocs. השתמש טיימר כיבוי כדי בחישה לאחר 8-10 ח
- עצור את ערבוב ולתת משקעים flocs על ידי כוח הכבידה של 8-10 ח
- איסוף מחדש המסת flocs. צנטריפוגה
- הסר את supernatant באמצעות משאבה peristaltic ו פיפטה פלסטיק מחוברת צינורית פלסטיק. לקבלת דוגמיות ממוסמר supernatant צריך להיות נאסף לתוך בקבוק וחיטוי פי נהלים פנימיים. בכל המקרים לא לדאוג לאסוף את גלולה.
- איסוף משקעים עם flocs (כ 500 מ"ל) לתוך בקבוק צנטריפוגות.
- מאזן את הסירים על ידי תוספת של 3.5 pH PSM.
- צנטריפוגה הסירים בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב XG 8000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. ברגע צנטריפוגות מפסיק, להסיר בזהירות את הסירים צנטריפוגה מ בצנטריפוגה.
- מאוד gently לשפוך וישאירו supernatant. עקבו האמצעים המתאימים לחומר זיהומיות.
- הוסף 7 מ"ל של חיץ פוספט לפרק את גלולה בבקבוק כל צנטריפוגה.
- לאחר flocs כבר מומס, למדוד ולהוסיף למאגר פוספט להגיע בנפח כולל של 10 מ"ל.
- Homogenize להתרכז ויראלי ידי vortexing ולהפיץ את 10 מ"ל לתוך microtubes נקי שאמור להיות קפוא ב -80 ° C עד צורך בניתוח נוסף.
2. חומצות גרעין ממוצא
- בצע מיצוי חומצות גרעין עם ערכת QIAamp נגיפי RNA מיני הבאים הוראות היצרן. ערכה זו מאפשרת את השימוש של פלטפורמת אוטומטי (כגון Qiacube, Qiagen).
3. PCR כמותי של adenoviruses האנושי (HAdV), polyomaviruses JC (JCPyV), adenoviruses חזירי (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV)
- כימות של עותקים בגנום בדגימות
- להכיןתמהיל qPCR באזור נפרד נקי באמצעות TaqMan הסביבה PCR מיקס מאסטר 2x (Applied Biosystems). התגובה מתרחשת צלחת תגובה 96-אופטי היטב מכוסה מכסה דבק אופטי. ריכוזים של מיקס מאסטר, primers ואת בדיקות מתוארים בטבלה 1.
- לאחר לערבב הוכן, 15μl aliquot לתוך זה גם כולל את הפקדים (ראה 3.2). הנפח הכולל של תגובה אחת אחרי תוספת של היעד יהיה 25μl (לערבב 15μl + מדגם 10μl או רגילה).
- מוסיפים את גרעין חומצה עקירות מן דגימות (10μl) באזור נפרד. הפעלה ישירה דילול של פי עשרה בתוך מים מטוהרים מדגם כל כפולים. מכסים את הבארות המכיל את הדגימות עם חלק לכסות דבק, לשמור את החלק השני של השער לשלב הבא.
- הוסף דילולים של תקן ה-DNA השעיות (10μl) מ GC/10μl 0-10 6 10 על ידי בשלושה עותקים ושימוש micropipette בשימוש בלעדי של סטןגודארד DNA. מומלץ להוסיף תקנים באזור מצויד קרינת UV להשמדת DNA פלסמיד ולנקות את micropipette לאחר כל שימוש. מכסים את הבארות המכיל את הסטנדרטים עם כיסוי מראש לחתוך את הדבק.
הערה: כדי להכין השעיות תקן לשמש כימות של עותקים בגנום, באזור ה-DNA היעד צריך להיות משובטים לתוך פלסמיד ו - לינארית. בשנת לכתובת הבאה תמצאו נוהל מפורט על איך ליצור עקומות רגיל עם תבניות DNA פלסמיד לשמש qPCR:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - בצע את qPCR למערכת נאותה בחירת הפרמטרים המתאימים (בהתחשב בשימוש לכסות דבק ואת הנפח הכולל של כל טוב, וכו '). הפעלה בעקבות הזהב AmpliTaq עבור 10 דקות בשעה 95 ° C, 40 מחזורים של הגברה מבוצעות כדלקמן: 15 זה על 95 מעלות צלזיוסו 1 דקות ב 60 ° C עבור HAdV, JCPyV ו BPyV, ו 15 שניות על 95 ° C, ה -20 בשעה 55 ° C ו -20 ב 60 ° C עבור PAdV.
- לאחר התגובות הושלמו, נתונים לאחסן תוצאות כמתואר במדריך למשתמש של הציוד שבשימוש. כמות ה-DNA יוגדר החציון של נתונים המתקבלים לאחר תיקון גורם לדילול בעת הצורך.
- בקרות
- השתמש בקרות חיוביות ושליליות. Assay חייב לכלול אחד או יותר שאינם תבנית שליטה (NTC) כדי להוכיח את תערובת אינו מייצר פלואורסצנטי. מומלץ להפעיל את בקרת תהליך חיובי על מנת להעריך את פוטנציאל עיכוב אנזימטי בשל מעכבי נוכח דגימות למד.
- שיא בתוצאות של מבחני qPCR שני דילולים שונים של ה-DNA רגיל מן לשלוט על התהליך. השתמש בתוצאות כדי להכין תרשימי בקרה על בקרת איכות (QC) תוכניות הקשורות הרגישות והיעילות של מבחני.
- אישורתוצאות
- תוצאות חיוביות ניתן אישור נוסף באמצעות רצף מקוננות-PCR ו נוקלאוטיד של amplicons, הפקת נתונים נוספים על רצפי נוקליאוטידים של זנים זיהה 1,5,6,7,9,12.
בעקבות ההליך המתואר, וירוסים אדם ובעלי חיים שזוהו לכמת במימי ים, ים ומים הנהר 2,3. כדוגמה מייצגת, מי התהום דגימות מאזורים להציג רמות גבוהות של חנקות הוערכו על מנת להגדיר את מקורות הזיהום. עשרה ליטר מים דגימות נאספו 4 בארות שונים באזורים כפריים של אזור בצפון מזרח ספרד. חמש משכפל נאספו לשכפל כל אחד לשלומו seeded עם adenovirus האדם 2 משמש שליטה בתהליך. דוגמאות עובדו על פי פרוטוקול מיוצג באיור 1. ארבעת משכפל ניתח אחד מארבעת האתרים למד הראו תוצאות חיוביות עבור PAdV (ממוצע ערך 7.72 4x10 GC / L) אשר יהיה קשור לנוכחות של slurries חזיר באזורים הסובבים את האתר הדגימה יתמכו זיהום צואתי חזירי כמקור של חנקות במי התהום (טבלה 2).
4. נציג תוצאות:
באיור 1. נוהל איתור וכימות של וירוסים במים.
טבלה 1. ריכוז primers ו בדיקות עבור מבחני qPCR.
טבלה 2. איתור וכימות של adenoviruses החיה האנושית polyomaviruses בדגימות מי התהום.
מספר n של משכפל ניתח
אחוז% מכלל חיובי משכפל
(-) לא מזוהה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך המתואר היו מקיימים את התנאים של שיטה מתאים שגרתי במעבדות בריאות הסביבה והציבור: לשחזור, אמינה, פשוטה וחסכונית. פרוטוקול היא פשוטה, אך היא חייבת להיות מלווה בזהירות. מוליכות נמוכה בדגימות מבלי להוסיף את הריכוז המבוקש של מלחי ים מלאכותי יהיה להפחית באופן דרמטי את ההתאוששות של וירוסים גם יהיה המקרה אם הזמן ערבוב הפתתה מצטמצם משמעותית (פחות מ 5 שעות, למשל).
מיושם כיום כלים MST מתבססים בדרך כלל על שיטות מולקולאריות. מחקרים שפותחה על ידי קבוצות שונות הראו כי מתוך הפרמטרים המשמשים כיום (כלומר גנים של חיידקים) אף הוא ספציפי כמו הצורך. לכן השימוש שילוב של פרמטרים אלה הוצע קירוב הטוב ביותר למעקב יעיל המוצא של זיהום צואתי בגופי מים 8,11.
"jove_content> בשנים האחרונות, המחקר של נגיפי DNA נבחרים המייצרים במקרים רבים זיהומים מתמידים העדר סימפטומים קליניים, התפתחה כשיטה זיהום מקור מעקב צואה בסביבה. כמותי טכניקות PCR ושיטת ריכוז המוצע לספק ערכים אמינה של ריכוז של וירוסים אלו נתונים חשובים מאוד לפיתוח של סיכון הערכת מחקרים ופעולות תיקון. טכניקות אלה גם רגיש מאוד ספציפי, המהווה דרישה מוחלטת למעקב אחר מקור הזיהום. כמו כן, הם להיות כלי מאוד שימושי עבור הדור של בסיסי נתונים גדולים יותר לאפיון כמותי של הפרשת והפצה של וירוסים ספציפיים המוצע כמקור מעקב אחר כלי חיידקים באזורים גיאוגרפיים שונים.ההליך המתואר מאפשר ניתוח של דגימות מרובות בו זמנית כ - 48 שעות ללא צורך עבודה אינטנסיביתs. הזמינות של שיטה זולה ויעילה ריכוז לתמוך את הישימות של HAdV ו JCPyV ו PAdV ו BPyV במים כמו חסכונית מבחני עבור כמותיים מקור מעקב אחר מחקרים מיקרוביאליים וזיהוי של המקור של מזהמים במי התהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
שתי בקשות פטנט שהוגשו בשנת 2009 כדי להגן על הקניין הרוחני של פרוטוקולים כימות PAdV ו BPyV.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הממשלה הספרדית "Ministerio de Educación y Ciencia" (פרויקט AGL2008-05275-C01/ALI), על ידי האיחוד האירופי למחקר Framework 7 פרויקטים במימון VIROBATHE (חוזה מס '513648), VIROCLIME (חוזה מס' 243923 ) ועל ידי הסוכנות קטלאנית של מים, Agència Catalana de l'Aigua (ACA), Departament דה קונטרול אני Millora dels Ecosistemes Aquatics. במהלך המחקר פיתחו מרתה Rusiñol היה בחור של ממשלת קטלאנית "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
