Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

की गतिविधि बढ़ाता सीआईएस विनियामक माउस रेटिना में तत्व

Published: June 28, 2011 doi: 10.3791/2821
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine

Summary

यह एक सरल और सस्ती explant electroporation के माध्यम से माउस retinas में रहने वाले सीआईएस नियामक तत्वों की गतिविधि (यानी, बढ़ाने / प्रमोटरों) यों प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. डीएनए तैयारी, रेटिना विच्छेदन, electroporation, रेटिना explant संस्कृति, और पोस्ट - निर्धारण विश्लेषण और मात्रा का ठहराव वर्णित हैं.

Protocol

1. Electroporation कक्ष का निर्माण

  1. एक 3.2mm अंतराल (हार्वर्ड उपकरण # 45-0105) (2A छवि) के साथ एक microslide, BTX मॉडल 453 के लिए . धातु पटरियों को पूरी तरह से स्लाइड के नीचे बंद किया जाना चाहिए.
  2. एक Dremel उपकरण का उपयोग करने के लिए एक प्लास्टिक microcentrifuge ट्यूब रैक से एक संभाल में कटौती. संभाल लंबाई 0.8cm, 0.6cm ऊंचाई, चौड़ाई 0.3cm (छवि 2B): 5 निम्नलिखित आयामों के साथ प्रत्येक छोटे आयताकार टुकड़ों में काटें. इन प्लास्टिक के टुकड़े पुन: प्रयोज्य spacers कि microslide कक्ष में अलग - अलग कुओं को ढालना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा रहे हैं.
  3. Microslide के धातु पटरियों के बीच प्लास्टिक spacers भी अंतराल पर डालें. spacers snugly फिट चाहिए (छवि 2C).
  4. P200 विंदुक टिप बंद टिप कट, 3ml सिरिंज टिप फिट, और 100% सिलिकॉन रबर मछलीघर सीलेंट के साथ सिरिंज को भरने. सीलेंट के साथ प्लास्टिक spacers के बीच अंतराल में भरें. नीचे से अंतराल के ऊपर इतना है कि कोई बुलबुले सीलेंट प्लग और microslide के आधार के बीच फार्म भरने के लिए सुनिश्चित करें.
  5. प्लास्टिक spacers के ऊपर एक धातु की छड़ प्लेस और यह बांधने की मशीन क्लिप के साथ जकड़ना, ताकि spacers जगह में आयोजित कर रहे हैं, जबकि सीलेंट dries (छवि 2 डी ई). चलो सीलेंट रातोंरात सूखे.
  6. बांधने की मशीन क्लिप, धातु की छड़ और प्लास्टिक spacers (छवि 2 एफ) निकालें. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए धातु पटरियों के ऊपर से सीलेंट साफ है. एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए microslide की जांच करने और सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले सिलिकॉन बांधों के नीचे मौजूद हैं. किसी भी सीलेंट फिल्म ऐसी है कि नंगे धातु कुओं के अंदर अवगत कराया है कुओं में गठन हो सकता है निकालें. एक अच्छी तरह से पानी के साथ भरें और यकीन है कि आसन्न अच्छी तरह से (ओं) में पानी रिसाव नहीं करता है. सभी कुओं के लिए दोहराएँ.
  7. समाप्त microslide पकवान के पक्ष में विंडो (छवि 2 जी) के लिए आसन्न धातु डंडे के साथ प्लास्टिक पकवान में फिट बैठता है, अंत में इलेक्ट्रोड धातु के खंभे से जुड़ी जाएगा.

2. डीएनए की तैयारी

  1. एक 1.5mL microcentrifuge ट्यूब बर्फ पर प्लास्मिड डीएनए मात्रा लाने 150μl के लिए आसुत जल के साथ जोड़ें. एकाधिक प्लाज्मिड प्रजातियों के सह - electroporation (जैसे, एक प्रयोगात्मक DsRed निर्माण और नियंत्रण GFP निर्माण) के लिए जोड़ा जा सकता है है. जब डीएनए की ट्यूब को जोड़ने के लिए, ध्यान में रखना है कि डीएनए विभाज्य के अंतिम मात्रा 60μl जाएगा राशि की गणना. आमतौर पर, प्रत्येक का निर्माण 0.5μg/μl की अंतिम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है.
  2. 15μl 3M सोडियम एसीटेट (5.2 पीएच) और 450μl 100% इथेनॉल जोड़कर डीएनए वेग. उलटें या ट्यूब नल कई बार करने के लिए मिश्रण.
  3. नीचे 4 में डीएनए स्पिन डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 13,200 rpm,. 70% इथेनॉल के साथ गोली धो, तो यह स्पिन नीचे फिर से 4 बजे डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 13,200 rpm,. एयर सूखे गोली अर्द्ध - पारदर्शी जब तक, 7 मिनट के बारे में है, तो 54μl बाँझ पानी में resuspend. 6μl बाँझ 10X पीबीएस (7.4 पीएच) और मिश्रण जोड़ें.

3. आँखों का संग्रह

  1. Electroporation कक्ष और 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों जीवाणुरहित. जबकि आँख संग्रह और विच्छेदन की जरूरत है एक टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन नहीं किया, अपने दस्ताने और इथेनॉल और प्रक्रिया भर बाँझ स्थिति बनाए रखने के प्रयास के साथ benchtop कीटाणुरहित.
  2. दो 35 मिमी व्यंजन 3ml मध्यम और एक साथ प्रत्येक विच्छेदन: (: F12, 100U/ml पेनिसिलिन, 100μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.29mg/ml एल glutamine, और 5μg/ml इंसुलिन DMEM के 1:1 के अनुपात) मध्यम के साथ पेट्री डिश तैयार 6ml माध्यम के साथ 60mm पकवान. यह कदम एक टिशू कल्चर हुड में किया जाना चाहिए.
  3. सिर और एक नवजात शिशु की गर्दन (प्रसव के बाद दिन 0) 70% इथेनॉल के साथ पिल्ला माउस कीटाणुरहित. जल्दी से कैंची से सिर काटना और एक बाँझ 100mm पकवान सिर हस्तांतरण.
  4. दूर छोटे से आँखों को बेनकाब कैंची के साथ खोपड़ी कट. घुमावदार संदंश का प्रयोग को धीरे से कक्षा के बाहर आंख स्कूप, आंख और एक 35 मिमी विच्छेदन मध्यम युक्त डिश में जगह है. यह उपयोगी हो सकता है कम शक्ति पर विदारक खुर्दबीन के नीचे आँखें निकाल सकते हैं.
  5. 3.3 और 3.4 चरणों को दोहराएँ जब तक सभी आँखें एकत्र किया गया है. कमरे के तापमान पर विच्छेदन मध्यम में आँखें रखें जबकि विदारक. आप प्रति डीएनए विभाज्य 3-4 आँखों की आवश्यकता होगी.

4. रेटिना विच्छेदन

  1. 70% इथेनॉल का उपयोग करने के लिए दोनों एक रेजर ब्लेड और एक बाँझ प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के आवरण कीटाणुरहित. ब्लेड के साथ विंदुक बंद टिप कट इतना है कि यह एक पूरी नजर चूसना कर सकते हैं. नहीं जब उपयोग में प्लास्टिक आवरण में पिपेट स्टोर.
  2. एक आंख से 35 मिमी पकवान से 60mm पकवान स्थानांतरण. उच्च शक्ति पर विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक संदंश का उपयोग करें, extraocular मांसपेशियों और वसा के रूप में आंख की सतह से, किसी भी ऊतक निकालने. फिर, यह आधार पर बंद pinching द्वारा ऑप्टिक तंत्रिका को हटा दें.
  3. मैं आदेश में रेटिना को अलग करने के लिए, एक छोटा सा छेद प्रहारकिनारी पर श्वेतपटल n. संदंश के दोनों जोड़े से छेद (रेटिना की सतह के लिए स्पर्शरेखा) में एक शूल और सम्मिलित धीरे श्वेतपटल / RPE खोलने के आंसू. अल्बिनो चूहों में श्वेतपटल और RPE रेटिना ऊतक है, जो एक सजातीय मैट ग्रे रंग चमकदार रिश्तेदार दिखाई देते हैं. Pigmented चूहों में, RPE काला है. जगह में लेंस छोड़ो.
  4. हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए माध्यम के साथ अन्य 35 मिमी पकवान में dissected रेटिना कदम.
  5. 4,4 करने के लिए 4,2 चरणों को दोहराएँ जब तक सभी आँखें dissected किया गया है.
  6. एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में retinas स्टोर जब तक आप electroporate के लिए तैयार हैं.

5. Electroporation के लिए तैयार

  1. मध्यम की 35 मिमी व्यंजन तैयार. प्रत्येक डीएनए electroporated हो विभाज्य के लिए, आप विच्छेदन के माध्यम से एक डिश और संस्कृति के माध्यम से एक डिश (विच्छेदन के माध्यम से अधिक 10% FBS) की आवश्यकता होगी. व्यंजन उचित लेबल.
  2. P200 विंदुक और बाँझ 1X पीबीएस प्रयोग electroporation डिश में कक्षों को धोने. प्रत्येक कक्ष 60 100μl की एक मात्रा रखती है. प्रत्येक कक्ष तीन बार धो लें.
  3. डीएनए aliquots के साथ कक्षों भरें. किसी भी अप्रयुक्त कक्षों 60μl 1X पीबीएस के साथ भरा जाना चाहिए. Electroporation पकवान इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
  4. Electroporator पर निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: मोड, एल.वी., वोल्टेज 30V, नाड़ी लंबाई, 50 मिसे, दालों, 5 की संख्या, अंतराल, 950 मिसे, polarity, एकध्रुवीय.

6. Electroporation

  1. ठीक संदंश का प्रयोग करें लेंस द्वारा retinas समझ और उन्हें electroporation कक्षों में स्थानांतरित करने के लिए. प्रत्येक कक्ष 3-4 माउस retinas (3 छवि) रखती है.
  2. ऐसी है कि लेंस सकारात्मक इलेक्ट्रोड से जुड़ी धातु पट्टी के खिलाफ leans retinas लाइन संदंश का प्रयोग करें. प्रत्येक स्थानांतरण के बाद एक Kimwipe एक कक्ष से डीएनए के अगले से अधिक ले जाने से बचने के साथ संदंश साफ़.
  3. एक बार सभी retinas गठबंधन कर रहे हैं, electroporator पर "प्रारंभ" दबाएँ. छोटे बुलबुले धातु नकारात्मक इलेक्ट्रोड से जुड़ी पट्टी पर फार्म चाहिए.
  4. इलेक्ट्रोड डिस्कनेक्ट और बंद electroporator बारी.
  5. धीरे retinas कक्ष की दीवारों से दूर ले जाने के संदंश का प्रयोग करें.
  6. एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक प्रयोग कक्षों से 35 मिमी विच्छेदन मध्यम युक्त व्यंजन में retinas हस्तांतरण.
  7. प्रत्येक कक्ष बाँझ 1X पीबीएस के साथ तीन बार धो, तो बाँझ पानी से कुल्ला. 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे पकवान.

7. संस्कृति के लिए फ़िल्टर पर रखकर retinas

  1. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए 35 मिमी संस्कृति के माध्यम से युक्त व्यंजन में retinas हस्तांतरण.
  2. लेबल एक बाँझ संस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं और 3ml मध्यम संस्कृति के साथ एक अच्छी तरह से भर.
  3. दौर वाटमान Nuclepore फिल्टर, चमकदार पक्ष मध्यम ऊपर ऊपर, प्रत्येक में अच्छी तरह से जगह बाँझ संदंश का प्रयोग करें.
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने के लिए फिल्टर, लेंस साइड नीचे पर retinas हस्तांतरण. यदि लेंस पक्ष रेटिना भूमि, पिपेट और इसे फिर से जगह करने का प्रयास के साथ उठा. एक फिल्टर पर अधिक से अधिक 4 retinas जगह है, और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक रेटिना आसपास मध्यम की बूंदों अन्य बूंदों से अलग रहना मत. ध्यान दें कि बरकरार लेंस के साथ हम रेटिना संस्कृति, हालांकि अन्य प्रोटोकॉल लेंस को हटाने के के लिए इस चरण 9 से पहले फोन .
  5. एक 37 में संस्कृति की थाली प्लेस ° सी टिशू कल्चर (5% सीओ 2) इनक्यूबेटर और समय के वांछित राशि, आम तौर पर आठ दिनों के लिए बढ़ती. हमारे अनुभव में, मध्यम बदलने आठ दिन संस्कृति की अवधि के दौरान अनावश्यक है, हालांकि एक मध्यम परिवर्तन अब संस्कृति अवधि के लिए आवश्यक हो सकता है.

8. फसल काटने वाले और flatmounting फ्लोरोसेंट रेटिना explants

  1. 4% paraformaldehyde / 1X पीबीएस के साथ प्रत्येक कुएं में संस्कृति के माध्यम से बदलें. यदि retinas फिल्टर करने के लिए अटक रहना, संदंश का उपयोग करने के लिए अधिक फिल्टर फ्लिप और धीरे से फिल्टर बंद retinas छील. Paraformaldehyde में 30 मिनट के लिए सेते हैं. कमरे के तापमान पर. प्रकाश प्रतिदीप्ति विरंजन से बचने से retinas को सुरक्षित रखें.
  2. 1X पीबीएस में 10 मिनट के लिए retinas दो बार कुल्ला.
  3. एक डिस्पोजेबल विंदुक प्रयोग पीबीएस की एक छोटी सी बूंद में एक गिलास स्लाइड पर retinas हस्तांतरण. एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश का उपयोग करने के लिए retinas फ्लिप इतना है कि वे electroporated साइड - अप कर रहे हैं (यानी, लेंस नीचे की ओर ).
  4. प्लेस गिलास "पैर" स्लाइड के कोनों पर कुचल coverslips (गिलास shards के बारे में व्यास में 1-2 मिमी) से बना है, इन पैर रेटिना के सपाट रोकने के. स्लाइड इतना है कि यह retinas और पैरों पर टिकी हुई है कवर पर बरकरार कांच coverslip रखें. यदि आवश्यक हो, पिपेट का उपयोग करने के लिए स्लाइड और coverslip के बीच अधिक पीबीएस जोड़ने.

9. Flatmount में इमेजिंग और प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव

  1. एक का प्रयोग करेंफ्लोरोसेंट यौगिक सूक्ष्मदर्शी एक मोनोक्रोम लाल और हरे रंग चैनलों में कम बिजली (4X उद्देश्य) flatmounted रेटिना छवि कैमरा के साथ सुसज्जित है. सभी retinas दिया फ्लोरोसेंट चैनल के लिए एक ही जोखिम समय के साथ imaged प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना सक्षम होना चाहिए. सुनिश्चित करें कि किसी भी छवि में पिक्सल संतृप्त नहीं कर रहे हैं, या किसी और सटीक मात्रा का ठहराव असंभव हो जाएगा. में निर्यात छवियों झगड़ा प्रारूप ग्रेस्केल.
  2. ImageJ सॉफ्टवेयर (में एक रेटिना (.. यानी, लाल चैनल और हरे चैनल) के लिए सेट छवि खोलें http://rsbweb.nih.gov/ij/) . इस ट्यूटोरियल के लिए, हरे रंग का फ्लोरोसेंट चैनल (GFP प्रोटीन) नियंत्रण का निर्माण है कि प्रयोग में सभी retinas भर में स्थिर है. लाल फ्लोरोसेंट चैनल (DsRed प्रोटीन) प्रयोगात्मक का निर्माण है कि retinas के प्रत्येक सेट के लिए भिन्न होता है. छवियों को ग्रेस्केल में किया जाना चाहिए.
  3. ImageJ में, नियंत्रण हरी छवि का चयन करें और व्यास 100 इकाइयों (विश्लेषण / / उपकरण रॉय प्रबंधक / / निर्दिष्ट) के साथ ब्याज की एक चक्र निर्दिष्ट. इस वृत्त (आरओआई प्रबंधक / जोड़ें) से आठ कुल हलकों बनाने के डुप्लिकेट. 1-5 हलकों में स्थानांतरित करने के लिए पांच क्षेत्रों का चयन करें कि समान electroporated हैं, रेटिना और लेंस (4A छवि) overlying क्षेत्र के बाहरी किनारों से परहेज. इसके अलावा, रेटिना / लेंस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मापने के बाहर तीन क्षेत्रों (हलकों 6-8) का चयन करें. लाल छवि का चयन करें, आरओआई प्रबंधक बॉक्स में "बॉक्स सभी दिखाएँ", और फिर जांच के लिए संयुक्त राष्ट्र की जांच. सभी आठ हलकों लाल छवि पर दिखाई देनी चाहिए. De-चयन करें सभी सर्कल आरओआई प्रबंधक में निर्देशांक.
  4. लाल छवि चयनित के साथ, ब्याज के सभी हलकों के लिए मतलब पिक्सेल मूल्य रिकॉर्ड (आरओआई प्रबंधक / उपाय), 1-8 माप दिखाई देते हैं, जहां 1-5 लाल रेटिना माप कर रहे हैं और 6-8 लाल रंग की पृष्ठभूमि माप हैं चाहिए. हरे रंग की छवि का चयन करें और मतलब पिक्सेल मूल्य रिकॉर्ड, 9-16 माप दिखाई देते हैं, जहां 9-13 हरी रेटिना माप कर रहे हैं चाहिए और 14-16 हरे रंग की पृष्ठभूमि माप हैं. Excel में माप डेटा विश्लेषण के लिए (छवि 5) को कॉपी करें.
  5. औसत तीन में दोनों लाल पृष्ठभूमि माप और हरे रंग चैनल. प्रत्येक लाल चैनल में पांच रेटिना माप के से लाल रंग की पृष्ठभूमि औसत घटाएँ, हरी चैनल के लिए दोहराने. प्रत्येक रेटिना क्षेत्र के हित के लिए, पृष्ठभूमि घटाया पृष्ठभूमि घटाया हरे रंग की माप के द्वारा लाल माप विभाजित क्रम में नियंत्रण हरी स्तर (छवि 5) प्रयोगात्मक लाल स्तर मानक के अनुसार.
  6. दिया DsRed का निर्माण (उदाहरण के लिए, रेटिना के 3 अलग retinas बार 5 प्रति माप) के लिए सभी सामान्यीकृत माप की औसत और मानक विचलन का निर्धारण करते हैं. आदेश में मात्रात्मक अलग अलग दिनों पर बाहर ले electroporations के परिणामों की तुलना करने के लिए, हमेशा एक "मानक" DsRed प्रत्येक electroporation सेट में / GFP वर्षण शामिल हैं. प्रयोगों भर सापेक्ष अभिव्यक्ति मूल्यों की अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य द्वारा तुलना किया जा सकता है "मानक."

10. प्रतिनिधि परिणाम:

1 / 4 भर में 1 / 3 डीएनए (ओं) (4A छवि) रेटिना की सतह के निर्माण की अभिव्यक्ति में एक अच्छा electroporation परिणाम. के बाद से विशेष रूप से रॉड photoreceptors कुशलता transduced कर रहे हैं, इस तकनीक फोटोरिसेप्टर विशिष्ट प्रमोटर गतिविधि (4B छवि) बढ़ाता के लिए आदर्श है. हम पहले इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल रॉड विशेष रो और Gnat1 10 loci से प्रमोटर वेरिएंट की एक सीमा यों. हमने पाया कि यह संभव है लगभग एक रेंज 300 गुना अधिक प्रमोटर गतिविधि यों है.

5 चित्रा एक एकल electroporated रेटिना से एक नमूना डाटासेट है. इस विशिष्ट उदाहरण में, प्रयोगात्मक निर्माण (1.1kb) pNrl DsRed लाल चैनल में मापा गया था और नियंत्रण निर्माण (3.2kb) pNrl GFP हरी चैनल में मापा गया था. PNrl के लिए एक पूर्ण डाटासेट (1.1kb) DsRed का निर्माण इस तरह से मापा 6-9 retinas से मिलकर बनता है, और सभी मानों "GFP के लिए सामान्यीकृत DsRed" पर आधारित मानक विचलन की गणना होगी. यदि हम pNrl की अभिव्यक्ति के स्तर (1.1kb) DsRed करने के लिए की तुलना रहे थे, उदाहरण के लिए, pNrl (0.8kb) - DsRed, तो दोनों constructs एक ही GFP नियंत्रण (जैसे, pNrl (3.2kb) के साथ electroporated की आवश्यकता होगी - ) GFP और एक ही जोखिम समय पर imaged. यह पूल डेटा अलग अलग दिनों पर एकत्र अगर एक मानक DsRed / GFP electroporation प्रत्येक दिन किया जाता है (उदाहरण के लिए, pNrl (3.2kb) dsRed pNrl + (3.2kb) GFP) के लिए संभव है . प्रत्येक प्रयोगात्मक निर्माण के लिए, सामान्यीकृत DsRed स्तर बाद में 'मानक' (pNrl (3.2kb) dsRed) की सामान्यीकृत DsRed स्तर पर सामान्यीकृत किया जाएगा.

तकनीक हम यहाँ का वर्णन मुख्य रूप से फोटोरिसेप्टर 10,13 Cres के गतिविधि बढ़ाता के लिए उपयोगी है.सेल प्रकार विशिष्ट सीआईएस नियामक गतिविधि भी दुर्लभ जैसे द्विध्रुवी 14 कोशिकाओं रेटिना प्रकार की कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन यह आमतौर पर की आवश्यकता है कि हित के क्षेत्रों के लिए मात्रा निर्धारित किया जा ऊर्ध्वाधर - पार वर्गों में flatmount तैयारी में बजाय चुना जा. उसी Cres जो photoreceptors और द्विध्रुवी कोशिकाओं के रूप में अनेक प्रकार की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति ड्राइव का सच है. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं अन्यथा समान हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 रेटिना explant electroporation प्रक्रिया का अवलोकन. पहले, पूरे आँखें प्रसवोत्तर दिन 0 माउस पिल्ले से अलग कर रहे हैं और retinas (P1) dissected हैं. दूसरा, retinas डीएनए और electroporated (P2) के साथ भरी कोठरियों में रखा जाता है. तीसरा, retinas फिल्टर पर रखा जाता है और आठ दिन (पी 3) के लिए सभ्य. चौथा, रेटिना explants तय कर रहे हैं, स्लाइड्स पर घुड़सवार, और imaged. प्रतिदीप्ति तीव्रता ImageJ सॉफ्टवेयर (पी 4) के साथ मापा जाता है. पांचवां, ImageJ डेटा एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में संसाधित कर रहे हैं विभिन्न प्रमोटरों (P5) की गतिविधि में अंतर यों.

चित्रा 2
चित्रा 2 electroporation पकवान का निर्माण. ए) हार्वर्ड उपकरण, BTX मॉडल 453 (सूची 45-0105 #) से असंशोधित microslide कक्ष. बी) एक Dremel उपकरण के लिए एक प्लास्टिक ट्यूब रैक बंद संभाल कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है. : लंबाई 0.8cm, 0.6cm ऊंचाई, चौड़ाई 0.3cm संभाल आयताकार spacers में निम्नलिखित आयामों के साथ कट जाता है. सी) प्लास्टिक spacers बराबर अंतराल पर microslide चेंबर में लगे हैं. मछलीघर सीलेंट spacers (नहीं दिखाया गया है) के बीच अंतराल में अंतःक्षिप्त है. डी) एक धातु पट्टी spacers पर रखा है. ई) पट्टी और spacers स्लाइड पर बांधने की मशीन क्लिप के साथ clamped सीलेंट dries के रूप में जगह में सब कुछ रातोंरात पकड़. एफ) spacers हटा दिया है और कुओं को सुनिश्चित करना है कि वे निर्विवाद हैं परीक्षण कर रहे हैं. जी) समाप्त स्लाइड पकवान के पक्ष में खिड़की के पास धातु सलाखों के साथ प्लास्टिक पकवान में फिट बैठता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 retinas के साथ electroporation पकवान की आरेख . कक्षों डीएनए समाधान (एक समय में पाँच अलग अलग समाधान) के साथ भर रहे हैं. Retinas संगठनों और उन्मुख में रखा जाता है ताकि लेंस सकारात्मक इलेक्ट्रोड से जुड़े धातु पट्टी के खिलाफ झुकाव है, तीन या चार retinas पांच कक्षों में से प्रत्येक में फिट होगा. बिजली के वर्तमान नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए अणु रेटिना की कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए कारण होगा.

चित्रा 4
चित्रा 4.) Flatmount में रेटिना प्रतिदीप्ति स्तर के ImageJ माप. ध्यान दें कि इन छवियों को केवल निदर्शी प्रयोजनों के लिए रंग गया है; DsRed (प्रयोगात्मक) और GFP चैनल (नियंत्रण) ImageJ सॉफ्टवेयर में खोल रहे हैं में flatmount छवियों ग्रेस्केल. पांच माप हलकों (1 से 5 तक) समान electroporated क्षेत्रों पर रखा जाता है, किनारों और लेंस (बिंदीदार लाइनों) से परहेज. तीन हलकों माप (6 से 8) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का स्तर निर्धारित करने के लिए रेटिना के बाहर रखा जाता है. बी) उच्च शक्ति पर एक electroporated रेटिना explant के क्रॉस अनुभागीय छवियों. explant प्रसव के बाद 8 दिन, 30% sucrose/1X पीबीएस में 4 पर रातोंरात cryoprotected ° सी, अक्टूबर में एम्बेडेड में तय किया गया था, और 12μm में क्रायो - sectioned. फ्लोरोसेंट constructs (1.1kb) pNrl DsRed और pNrl (3.2kb) GFP बाहरी परमाणु परत (ONL) में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं. लीग, भीतर परमाणु परत, GCL, नाड़ीग्रन्थि सेल परत.

चित्रा 5
चित्रा 5 प्रतिदीप्ति Excel का उपयोग कर डेटा के प्रसंस्करण. चरण 1 में, प्रत्येक माप सर्कल के लिए मतलब पिक्सेल मूल्य स्प्रेडशीट (कोशिकाओं B3 बी 12, F3-F5, H3-H5) में नकल है. 1-5 # माप DsRed रेटिना मान रहे हैं और 6-8 # DsRed पृष्ठभूमि मान रहे हैं, 9-13 # माप GFP रेटिना मान रहे हैं और 14-16 # GFP पृष्ठभूमि मान रहे हैं. ध्यान दें कि # 1 और # 9 माप को ही माप के चक्र को अनुरूप, के रूप में # 2 # 10 माप, और इतने पर. चरण 2 में, DsRed और GFP चैनलों के लिए औसत पृष्ठभूमि मूल्य (F6 कोशिकाओं, H6) की गणना की जाती है. चरण 3 में, औसत पृष्ठभूमि हर रेटिना माप से subtracted है (कोशिकाओं C3 C12). चरण 4 में, प्रत्येक पृष्ठभूमि घटाया DsRed माप अपनी इसी GFP माप (D3-D7 कोशिकाओं) के लिए सामान्यीकृत है.

Discussion

Explant electroporation विकासशील माउस रेटिना में सीआईएस नियामक गतिविधि को बढ़ाता का एक सरल साधन है . सीआईएस नियामक माउस transgenesis के माध्यम से विश्लेषण की तुलना में, electroporation बहुत सस्ता है, केवल नवजात माउस पिल्ले, डीएनए, विदारक उपकरणों, और electroporation / टिशू कल्चर के उपकरण की आवश्यकता होती है. यह भी अब तक कम समय लेने: इमेजिंग और डेटा विश्लेषण के लिए प्रयोग के अंत में एक प्रयोग तैयारी के समय का केवल कुछ घंटे, के बारे में आठ दिनों की एक संस्कृति अवधि, और कुछ ही घंटों की आवश्यकता है. Explant electroporation भी सेल संस्कृति आधारित सीआईएस नियामक विश्लेषण करने के लिए बेहतर है के बाद से वास्तविक रेटिना ऊतक का उपयोग किया जाता है. रेटिना explant में काफी सामान्य रूप से विकसित संस्कृति के तीन अलग सेलुलर परत (बाहरी परत परमाणु, भीतर परमाणु परत, और नाड़ीग्रन्थि सेल परत) रूपों, हालांकि photoreceptors बाहरी क्षेत्रों विस्तृत विफल.

एक और लाभ यह है कि explant electroporation अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि. अलग अलग दिनों पर भी, एक ही अलग retinas में electroporated constructs एक ही रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर में आमतौर पर परिणाम. इसके अलावा, के बाद से electroporated plasmids episomally नाभिक में बनाए रखा जाना लगा रहे हैं और क्रोमोसोम में शामिल नहीं हैं, वे एक ही एकीकरण साइट प्रभाव है कि सीआईएस विनियामक ट्रांसजेनिक चूहों में प्रदर्शन विश्लेषण भरमाना के अधीन होना नहीं दिखाई देते हैं.

Explant electroporation कई सीमाएं है. सबसे पहले, केवल कोशिकाओं है कि सेल चक्र में अभी भी कुशलता से 15 electroporation द्वारा transduced किया जा सकता है. P0, छड़ और बाद में जन्मे अन्य रेटिना सेल प्रकार (द्विध्रुवी कोशिकाओं, amacrine कोशिकाओं, एम ller glia) मुख्य सेल इस विधि द्वारा लक्षित आबादी रहे हैं. P0 electroporation द्वारा शंकु photoreceptors के electroporation 16 सूचित किया गया है लेकिन दक्षता को कम प्रतीत होता है. एक दूसरी सीमा है कि रेटिना के प्रगतिशील कुरूपता में दो सप्ताह के परिणाम से परे explant संस्कृति है और इसलिए की सिफारिश नहीं है. अगर प्रमोटर मात्रा का ठहराव देर timepoints में आवश्यक है, तथापि, एक 9 electroporation vivo में प्रदर्शन किया जा सकता है बाद रेटिना विच्छेदन द्वारा वांछित timepoint, dissected रेटिना के फ्लैट बढ़ते, और मात्रा का ठहराव के रूप में धारा 9 में वर्णित है. एक तीसरा सीमा है कि इस परख केवल मामूली उच्च throughput है. सेल संस्कृति आधारित assays है कि एक ही प्रयोग में constructs के सैकड़ों का परीक्षण कर सकते हैं के विपरीत, इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक निर्माण प्रति पूरे माउस रेटिना की एक न्यूनतम आवश्यकता है. इस प्रकार, केवल एक जोड़ी दर्जन constructs यथोचित एक दिन में electroporated जा सकता है.

प्रमोटर वर्तमान दृष्टिकोण का उपयोग कर गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए सम्मान के साथ एक अतिरिक्त चेतावनी है कि वहाँ GFP चैनल में DsRed प्रतिदीप्ति के खून के माध्यम से 'के लिए, खासकर जब बहुत मजबूत प्रमोटरों परख करने की क्रिया एक संभावित है. इस के लिए कारण है कि उत्सर्जन के स्पेक्ट्रम GFP की है कि आंशिक रूप से overlaps DsRed. इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, अनुकूलित उत्सर्जन फिल्टर इस्तेमाल किया जा सकता है कि DsRed और GFP के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करना चाहिए. जब ऐसे अनुकूलित फिल्टर सेट उपलब्ध नहीं हैं, एक और संभावित समाधान GFP के एवज में एक नीली स्थानांतरित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, BFP या CFP) का उपयोग होगा .

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों करेन लॉरेंस electroporation कक्ष के निर्माण का वर्णन अनुभाग के साथ उसकी मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electroporation dish, Microslide 453 BTX Technologies 45-0105 See protocol section 1 for modifications
100% silicone rubber aquarium cement Perfecto Manufacturing
Plastic microtube rack Fisher Scientific 05-541 Only the rack handle will be used
Dremel tool For cutting the handle off the plastic tube rack
DMEM GIBCO, by Life Technologies 11965
F12 GIBCO, by Life Technologies 11765
L-Glu/pen/strep GIBCO, by Life Technologies 10378-016 100X concentration
Insulin Sigma-Aldrich I-6634 For 1000X stock, resuspend at 5mg/ml in 5mM HCl and filter-sterilize
FBS GIBCO, by Life Technologies 26140-079
ECM 830 Square-wave electroporator BTX Technologies
Nuclepore filters Whatman, GE Healthcare 110606 25mm, 0.2μm
Tissue culture incubator 37°C, 5% CO2
Glass coverslips #1.5 Fisher Scientific 12-544E 0.16mm thick
Fluorescent compound microscope equipped with camera Camera should be monochromatic (e.g., ORCA-ER camera by Hamamatsu)
EGFP/DsRed filter set for compound microscope Chroma Technology Corp. 86007 This filter set minimizes bleedthrough between the red and green chanenels
ImageJ Software National Institutes of Health http://rsbweb.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).
  2. Davidson, E. H. Genomic regulatory systems : development and evolution. , Academic Press. (2001).
  3. Ptashne, M., Gann, A. Genes & signals. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).
  4. Blow, M. J. ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers. Nat Genet. 42, 806-810 (2010).
  5. Visel, A. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  6. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
  8. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
  9. Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
  10. Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites. Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).
  11. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine. J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).
  12. Young, R. W. Cell differentiation in the retina of the mouse. Anat Rec. 212, 199-205 (1985).
  13. Corbo, J. C. CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors. Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).
  14. Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression. J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
  15. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  16. Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation. Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 52 रेटिना फोटोरिसेप्टर सीआईएस नियामक तत्व है मात्रा का ठहराव electroporation प्रमोटर विश्लेषण
की गतिविधि बढ़ाता<em> सीआईएस</emExplant electroporation> विनियामक माउस रेटिना में तत्व
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Montana, C. L., Myers, C. A., Corbo, … More

Montana, C. L., Myers, C. A., Corbo, J. C. Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2821, doi:10.3791/2821 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter