Kvantifiera aktivitet Cis-Reglerande element i musen Retina av Explantation elektroporation

Summary

Detta protokoll beskriver ett enkelt och billigt sätt att kvantifiera aktiviteten hos cis-reglerande element (dvs förstärkare / projektansvariga) i levande mus näthinnor via Explantation elektroporation. DNA-preparation, retinal dissektion, elektroporation, retinal Explantation kultur, och efter fixering analys och kvantifiering beskrivs.

Abstract

Transkriptionsfaktorer inom cellulär gen nätverk styr Spatiotemporal mönster och nivåer av uttryck av sina mål gener genom att binda till cis-reglerande element (Cres), korta (~ 300-600 bp) sträckor av arvsmassans DNA som kan ligga uppströms, nedströms eller inom den introner av de gener som de kontrollerar. Cres (dvs förstärkare / projektansvariga) består typiskt av flera klustrade bindningsställen för både transkriptionell aktivatorer och repressors ^1-3. De fungerar som logiska integratörer av transkriptionell ingång ger en enhetlig effekt i form av spatiotemporally exakt och kvantitativt exakt promotor aktivitet. De flesta studier av däggdjur cis-reglering har hittills förlitat sig på musen genmodifiering som ett sätt att testmetoder för att Enhancer Cres ^4-5. Denna teknik är tidsödande, kostsamt och, på grund av effekter insättningsstället, till stor del icke-kvantitativa. Å andra sidan har kvantitativa analyser för däggdjur CRE funktion utvecklats i system vävnadsodling (t.ex. dubbla luciferas analyser), men in vivo relevansen av dessa resultat är ofta osäkra.

Elektroporation erbjuder ett utmärkt alternativ till traditionell mus genmodifiering eftersom den tillåter både Spatiotemporal och kvantitativ bedömning av cis-reglering inom levande däggdjur. Denna teknik har varit särskilt användbar i analysen av cis-reglering i det centrala nervsystemet, särskilt i hjärnbarken och näthinnan ^6-8. Medan mus retinal elektroporation, både in vivo och ex vivo, har utvecklats och utförligt beskrivs av Matsuda och Cepko ^6-7,9, har vi nyligen utvecklat en enkel metod att kvantifiera aktiviteten hos fotoreceptor-specifika Cres i electroporated mus näthinnor ^10. Med tanke på att mängden DNA som förs in i näthinnan som elektroporation kan variera från experiment till experiment, är det nödvändigt att inkludera en co-electroporated "Lastkontroll" i alla experiment. I detta avseende är den teknik som påminner mycket om den dubbla luciferas analysen används för att kvantifiera promotor aktiviteten i odlade celler.

När testmetoder fotoreceptor cis-reglerande verksamhet, är elektroporation vanligtvis hos nyfödda möss (postnatal dag 0, P0) vilket är den tid av topp spö produktionen ^11-12. När näthinnan celltyper bli efter mitotiska är elektroporation mycket mindre effektiv. Med tanke på den höga stången födelse i nyfödda möss och det faktum att stängerna utgör mer än 70% av cellerna i den vuxna musen näthinnan, de flesta celler som är electroporated på P0 är stavar. Av denna anledning spö fotoreceptorer är lättast näthinnans celltyp att studera via elektroporation. Tekniken vi beskriver här är framförallt användbart för att kvantifiera aktivitet fotoreceptor Cres.

Protocol

1. Byggandet av elektroporation kammaren

1. Beställ en microslide, BTX modell 453 med en 3,2 mm gap (Harvard Apparatus # 45-0105) (Fig. 2A). Metallen skenorna bör vara helt tät i botten av bilden.
2. Använd en Dremel verktyg för att skära ett handtag av plast mikrocentrifugrör rack. Skär handtaget till 5 små rektangulära bitar vardera med följande dimensioner: längd 0.8cm, höjd 0.6cm, bredd 0.3cm (Fig. 2B). Dessa plastbitar är återanvändbara distanser som ska användas för att forma enskilda brunnar i microslide kammaren.
3. Sätt plast distanser mellan metall skenor av microslide med jämna mellanrum. Distanserna bör passa väl (Fig. 2C).
4. Skär av spetsen en P200 pipettspets, passa tips till en 3 ml spruta och fyll sprutan med 100% silikongummi akvarium tätningsmedel. Fylla luckorna mellan plast distanser med tätningsmedel. Var noga med att fylla luckorna nerifrån och upp så att inga bubblor bildas mellan tätningsmedel kontakten och basen av microslide.
5. Placera en metall stav ovanpå plastdistanser och fäst det med bindemedel klipp, så att distanserna hålls på plats medan tätningsmedlet torkar (bild 2D-E). Låt tätningsmedlet torka över natten.
6. Ta bort bindemedel klipp, metall stav, och plast distanser (Fig. 2F). Använd en skalpell blad för att rengöra tätningsmedel från toppen av metall räls. Använd en dissekera mikroskop för att undersöka microslide och se till att inga bubblor finns i botten av silikon dammar. Ta bort alla tätningsmedel film som kan ha bildats i brunnarna så att plåten exponeras inuti brunnarna. Fyll en väl med vatten och se till att vattnet inte läcker ut i intilliggande väl (s). Upprepa för alla brunnar.
7. Den färdiga microslide passar i plast skålen med metallstavar intill fönstret på sidan av skålen (fig. 2G), elektroderna kommer så småningom att bifogas metallstavar.

2. DNA-preparation

1. Lägg plasmid-DNA ett 1,5 mL mikrocentrifugrör på is och ta upp volymen till 150μl med destillerat vatten. Flera plasmid arter kan kombineras för samarbete elektroporation (t.ex. en experimentell DsRed konstruera och en kontroll GFP konstruktion). Vid beräkningen av DNA för att lägga till röret, kom ihåg att den slutliga volymen av DNA alikvot kommer att 60μl. Normalt är varje konstruera används vid en slutlig koncentration av 0.5μg/μl.
2. Fällning DNA genom att lägga 15μl 3M natriumacetat (pH 5,2) och 450μl 100% etanol. Invertera eller knacka röret flera gånger för att blanda.
3. Spinn ner DNA vid 4 ° C, 13.200 rpm, i 30 minuter. Tvätta pelleten med 70% etanol, sedan snurra den ner igen vid 4 ° C, 13.200 rpm, i 15 minuter. Lufttorka pellets tills halvt genomskinlig, ca 7 minuter, sedan återsuspendera i 54μl sterilt vatten. Lägg 6μl steril 10X PBS (pH 7,4) och blanda.

3. Eye kollektion

1. Sterilisera elektroporation kammaren och alla instrument med 70% etanol. Medan ögat insamling och dissektion behöver inte göras i en vävnad kultur huva, desinficera dina handskar och stationära maskiner med etanol och försök att upprätthålla sterila förhållanden under hela förfarandet.
2. Förbered petriskålar med dissektion medelhög (1:1 förhållandet DMEM: F12, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 0.29mg/ml L-glutamin, och 5μg/ml insulin): två 35 mm rätter vardera med 3 ml medium och en 60mm fat med 6 ml medium. Detta steg bör utföras i en vävnadsodling huva.
3. Desinficera huvud och hals på en nyfödd (postnatal dag 0) mus valp med 70% etanol. Snabbt halshugga med sax och för över huvudet till en steril 100mm maträtt.
4. Klipp bort hårbotten med en liten sax för att exponera ögonen. Använd böjd pincett för att försiktigt ösa ögat ur omloppsbana, och placera ögat i en 35mm maträtt som innehåller dissektion medium. Det kan vara till hjälp för att ta bort ögonen under ett dissekera mikroskop med låg effekt.
5. Upprepa steg 3,3 och 3,4 tills alla ögon har samlats in. Håll ögonen på dissektion medel vid rumstemperatur medan dissekera. Du behöver 3-4 ögon per DNA-delmängd.

4. Retinal dissektion

1. Använd 70% etanol för att desinficera både ett rakblad och täckblad av en steril plast överföringspipett. Skär av spetsen på pipetten med klingan så att den kan suga upp en hel öga. Förvara pipetten i plast omslag när den inte används.
2. Överför ett öga från 35mm skålen till 60mm skålen. Enligt dissecting mikroskop med hög effekt, använd fin pincett för att avlägsna vävnad, såsom extraocular muskler och fett från ytan av ögat. Ta sedan bort synnerven genom att nypa bort det vid basen.
3. För att isolera näthinnan, peta ett litet hål in sklera vid limbus. Sätt ett stift från båda par pincett i hålet (tangerar näthinnans yta) och försiktigt riva öppna sklera / RPE. I albino möss, sklera och RPE verkar glänsande förhållande till näthinnans vävnad, vilket är en homogen matt grå färg. I pigmenterade möss är RPE svart. Låt linsen på plats.
4. Använd överföringspipetten att flytta dissekerat näthinnan i den andra 35mm skålen med medium.
5. Upprepa steg från 4,2 till 4,4 tills alla ögon har dissekerat.
6. Förvara näthinnor i ett 37 ° C vävnadsodling inkubator tills du är redo att electroporate.

5. Förberedelse för elektroporation

1. Förbered 35mm rätter av medium. För varje DNA alikvot vara electroporated, behöver du ett fat med dissektion medelstora och ett fat med odlingssubstrat (dissektion medel ökat med 10% FBS). Märk disken på lämpligt sätt.
2. Använd en P200 pipett och sterila 1X PBS att skölja ur kamrarna i elektroporering skålen. Varje kammare har en volym på 60-100μl. Skölj ur varje kammare tre gånger.
3. Fyll kammare med DNA alikvoter. Oanvänd kammare bör fyllas med 60μl 1X PBS. Anslut elektroderna till elektroporation skålen.
4. Använd följande inställningar på electroporator: mode, LV, spänning, 30V, pulslängd, 50 ms, antal pulser, 5, intervall, 950 msek, polaritet, unipolär.

6. Elektroporation

1. Använd fin pincett för att ta tag i näthinnor genom linsen och överföra dem till elektroporation kamrarna. Varje kammare rymmer upp till 3-4 musen näthinnor (Fig. 3).
2. Använd pincett för att rada upp näthinnor så att linsen lutar sig mot metall stång fäst vid positiva elektroden. Rengör pincetten med en Kimwipe efter varje överföring för att undvika överföring av DNA från en kammare till nästa.
3. När alla näthinnor är justerade, tryck på "Start" på electroporator. Små bubblor ska form på metall stång fäst vid negativa elektroden.
4. Koppla bort elektroderna och stänga av electroporator.
5. Använd pincett för att försiktigt flytta näthinnor från kammarens väggar.
6. Använd en steril överföringspipett att överföra näthinnor från kamrarna i 35mm rätterna innehåller dissektion medium.
7. Skölj ur varje kammare tre gånger med sterilt 1X PBS och skölj sedan med sterilt vatten. Spray fat med 70% etanol.

7. Placering näthinnor på filter för kultur

1. Använd en överföringspipett att överföra näthinnor i 35mm rätterna innehåller odlingsmedium.
2. Etikett brunnarna i en steril 6-bra kultur plattan och fyll varje brunn med 3 ml odlingsmedium.
3. Använd steril tång för att placera runt Whatman Nuclepore filter, blanka sidan uppåt, ovanpå mediet i varje brunn.
4. Enligt en dissekera mikroskop, använder en steril överföringspipett att överföra näthinnor på filtret, lins-och-ner. Om näthinnan landar lins-side-up, plocka upp med pipett och försöker placera det igen. Placera inte mer än 4 näthinnor på ett filter och se till att dropparna av medium kring varje näthinna hållas åtskilda från de andra droppar. Observera att vi kulturen näthinnan med linsen intakt, även om andra protokoll kräver att avlägsna linsen innan detta steg ^9.
5. Placera kultur plattan i 37 ° C vävnadsodling inkubator (5% CO ₂₎ och växa för önskad tid, vanligtvis åtta dagar. Vår erfarenhet är att ändra mediet är onödigt under åtta dagar kulturen perioden, men ett medium förändring kan krävas för längre kultur perioder.

8. Skörd och flatmounting fluorescerande näthinnan explants

1. Byt substratet i varje brunn med 4% paraformaldehyd / 1X PBS. Om näthinnor fastnar i filter, använda pincett för att vända filter över och försiktigt skala näthinnor bort filtret. Inkubera i paraformaldehyd i 30 min. vid rumstemperatur. Skydda näthinnor från ljus för att undvika blekning av fluorescensen.
2. Skölj näthinnor två gånger i 10 minuter i 1X PBS.
3. Använd en engångspipett att överföra näthinnor på en glasskiva i en liten droppe PBS. Enligt en fluorescerande dissekera mikroskop, använder pincett för att vända näthinnor så att de är electroporated-side-up (dvs lins-och-ned).
4. Placera glas "fötter" gjorda av krossade täckglas (glas skärvor ca 1-2 mm i diameter) i hörnen av bilden, dessa fötter förhindra flackare näthinnan. Placera en intakt glas täckglas över bilden så att den täcker näthinnor och vilar på fötterna. Om det behövs, använd en pipett för att lägga till fler PBS mellan bild och täckglas.

9. Avbildning och kvantifiering av fluorescens i flatmount

1. Använd ettfluorescerande förening mikroskop utrustat med en monokrom kamera för att bilden flatmounted näthinnan vid låg effekt (4X mål) i de röda och gröna kanalerna. Alla näthinnor måste avbildas med samma exponeringstid för en given fluorescerande kanal att möjliggöra jämförelser av fluorescens intensitet. Se till att pixlarna inte är mättade i någon bild, annars exakt kvantifiering kommer att vara omöjligt. Exportera bilder i gråskala TIFF-format.
2. Öppna bilden som för en näthinnan (det vill säga .., röd kanal och gröna kanalen) i ImageJ mjukvara ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). För att skapa denna tutorial, är det grönt fluorescerande kanal (GFP protein) kontrollen konstruktion som är konstant över alla näthinnor i försöket. Den röda fluorescerande kanalen (DsRed protein) är experimentell konstruktion som varierar för varje uppsättning näthinnor. Bilderna ska vara i gråskala.
3. I ImageJ, välj kontrollen gröna bilden och ange en cirkel av intresse med diametern 100 enheter (Analyze / Verktyg / ROI chef / Mer / Ange). Duplicera denna cirkel (ROI chef / Lägg till) för att skapa åtta cirklar totalt. Flytta cirklar 1-5 för att välja fem regioner som jämnt är electroporated, undvika ytterkanterna av näthinnan och regionen överliggande linsen (Figur 4A). Dessutom väljer tre regioner (cirklar 6-8) utanför näthinnan / objektiv för att mäta bakgrundsfluorescens. Välj den röda bilden, avmarkerar "Visa alla" rutan i ROI chef, och åter markera rutan. Alla åtta cirklar ska visas på den röda bilden. Avmarkera alla cirkel koordinaterna i ROI manager.
4. Med den röda bilden valts in genomsnittsvärdena pixelvärde för alla cirklar av intresse (ROI chef / åtgärd), mätningar 1-8 ska visas, där 1-5 är de röda retinal mätningar och 6-8 är röd bakgrund mätningar. Välj den gröna bilden och spela in medelvärdet pixelvärdet, mätningar 9-16 skall infinna sig, där 9-13 är de gröna retinala mätningar och 14-16 är grön bakgrund mätningar. Kopiera mätdata till Excel för analys (Fig. 5).
5. Genomsnitt tre bakgrunden mätningar i både röda och gröna kanalerna. Subtrahera röd bakgrund genomsnitt från varje av de fem retinal mätningar i den röda kanalen, upprepa för den gröna kanalen. För varje retinal region-av-intresse, dela bakgrunden-korrigerad rött mätning av bakgrunden subtraheras-gröna mätning för att normalisera den experimentella röda nivå för att kontrollen gröna nivå (se diagram 5).
6. Bestäm medelvärde och standardavvikelse för alla normaliserade mätningar för ett givet DsRed konstruktion (t.ex. 5 mätningar per näthinnan gånger 3 separata näthinnor). För att kvantitativt kunna jämföra resultaten av electroporations utförs på olika dagar, alltid en "standard" DsRed / GFP nederbörd i varje elektroporering set. Relativa uttryck värden i olika experiment kan jämföras genom att normalisera till uttrycket nivån på denna "standard".

10. Representativa resultat:

En bra elektroporation resultat i uttryck av DNA konstruera (s) över 1 / 4 till 1 / 3 av näthinnans yta (fig. 4A). Eftersom staven fotoreceptorer särskilt effektivt transduced, är denna teknik idealisk för att kvantifiera fotoreceptor-specifika promotorn aktivitet (Fig. 4B). Vi använde tidigare denna metod att kvantifiera ett urval av promotorn varianter från stav-specifika Rho och Gnat1 loci ^10. Vi fann att det är möjligt att kvantifiera promotor aktivitet över en nästan 300-faldig sortiment.

Figur 5 är ett exempel datauppsättning från en enda electroporated näthinnan. I detta exempel var den experimentella konstruera pNrl (1.1kb)-DsRed mäts i den röda kanalen och kontroll konstruera pNrl (3.2kb)-GFP uppmättes i den gröna kanalen. En komplett uppsättning data för pNrl (1.1kb)-DsRed konstruera skulle bestå av 6-9 näthinnor mätt på detta sätt, och standardavvikelse skall beräknas på grundval av alla "DsRed normaliserad till GFP" värden. Om vi skulle jämföra uttrycket nivå pNrl (1.1kb)-DsRed till exempel, pNrl (0.8kb)-DsRed, då båda konstruktioner skulle behöva electroporated med samma GFP kontroll (t.ex. pNrl (3.2kb) - GFP) och avbildade på samma exponeringstider. Det är möjligt att samla data som samlas in på olika dagar om en standard DsRed / GFP elektroporation utförs på varje dag (t.ex. pNrl (3.2kb)-dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP). För varje experimentell bygga skulle normaliserade DsRed nivån sedan normaliseras till den normaliserade DsRed nivån för "standard" (pNrl (3.2kb)-dsRed).

Tekniken vi beskriver här är framförallt användbart för att kvantifiera aktiviteten hos fotoreceptor CRES ^10,13.Cell-typspecifika cis-reglerande aktivitet kan också kvantifieras i ovanligare näthinnan celltyper som bipolär celler ^14, men det oftast kräver att områden av intresse för kvantifieras väljas vertikala tvärsnitt snarare än i flatmount förberedelser. Detsamma gäller Cres som driver uttryck i flera celltyper som fotoreceptorer och celler bipolär. Den experimentella förfaranden i övrigt är likartade.

Figur 1. Översikt av näthinnans Explantation elektroporation förfarande. Först hela ögon är isolerade från postnatal dag 0 mus ungar och näthinnor är dissekeras (P1). För det andra är de näthinnor placeras i kammare fyllda med DNA och electroporated (P2). Det tredje är de näthinnor placeras på filter och odlade i åtta dagar (P3). Det fjärde är de retinala explants fasta, monterade på diabilder och avbildas. Fluorescensintensitet mäts med ImageJ programvara (P4). Det femte är ImageJ uppgifter som behandlas i ett kalkylprogram för att kvantifiera skillnaderna i aktivitet av olika projektansvariga (P5).

Figur 2. Byggandet av elektroporation skålen. A) Oförändrad microslide kammare från Harvard Apparatur, BTX-modell 453 (katalog # 45-0105). B) En Dremel-verktyg används för att skära i handtaget av en plastslang rack. Handtaget är skuren i rektangulära distanser med följande mått: längd 0.8cm, höjd 0.6cm, bredd 0.3cm. C) plastdistanser monteras in i microslide kammaren med lika stora intervaller. Akvarium tätningsmedel sprutas in i mellanrummen mellan distanserna (visas inte). D) En metall bar placeras över distanser. E) Baren och distanser är fästa på bilden med bindemedel clips för att hålla allt på plats som tätningsmaterial torkar över natten. F) distanser tas bort och brunnar testas för att säkerställa att de är vattentäta. G) Den färdiga bilden passar in i plast skålen med metallstänger i anslutning till fönstret på sidan av skålen.

Figur 3. Diagram i elektroporation skålen med näthinnor. Kamrarna är fyllda med DNA-lösningar (upp till fem olika lösningar på en gång). Näthinnor är placerade i kammare och orienterade så att linsen lutar mot metal bar ansluten till den positiva elektroden, tre eller fyra näthinnor kommer att passa i alla de fem kammare. Den elektriska strömmen kommer att orsaka de negativt laddade DNA-molekyler för att flytta in i näthinnans celler.

Figur 4. A) ImageJ mätning av näthinnans fluorescens nivåer i flatmount. Gråskala flatmount bilder i DsRed (experimentell) och GFP (kontroll)-kanaler öppnas i ImageJ programvara, observera att dessa bilder har färgade illustrativ. Fem mätningar cirklar (1 till 5) är placerade över enhetligt electroporated regioner, undvika kanter och objektiv (streckade linjer). Tre mätningar cirklar (6 till 8) är placerade utanför näthinnan för att fastställa bakgrundsnivåerna fluorescens. B) Tvärsnittsdata bilder av en electroporated retinal Explantation på hög effekt. Den Explantation fastställdes till postnatal dag 8, cryoprotected i 30% sucrose/1X PBS över natten vid 4 ° C, inbäddade i oktober, och Cryo-delad på 12μm. Den fluorescerande konstruerar pNrl (1.1kb)-DsRed och pNrl (3.2kb)-GFP uttrycks i fotoreceptor celler i det yttre nukleära lagret (ENDA). INL, inre nukleära lagret, GCL, ganglion cellager.

Figur 5. Behandling av fluorescens data med hjälp av Excel. I steg 1 är medelvärdet pixelvärde för varje mätning cirkel kopieras till tabellen (cellerna B3-B12, F3-F5, H3-H5). Mått # 1-5 är DsRed retinala värderingar och # 6-8 är DsRed bakgrunden värderingar, mätningar # 9-13 är GFP retinala värderingar och # 14-16 är GFP bakgrunden värden. Observera att mätning # 1 och # 9 motsvarar samma mätning cirkel, som gör mätningar # 2 och # 10, och så vidare. I steg 2 är den genomsnittliga bakgrunden värde för DsRed och GFP kanaler beräknas (celler F6, H6). I steg 3 är den genomsnittliga bakgrunden subtraheras från varje retinala mätning (cellerna C3-C12). I steg 4, var bakgrunden-korrigerad DsRed mätningen är normaliserat till motsvarande GFP mätning (cellerna D3-D7).

Discussion

Explantation elektroporation är ett enkelt sätt att kvantifiera cis-reglering inom utvecklingsländerna musen näthinnan. Jämfört med cis-rättsliga analys via musen genmodifiering är elektroporation mycket billigare och kräver endast nyfödda mus ungar, DNA, dissekera instrument och elektroporation / vävnadsodling utrustning. Det är också mycket mindre tidskrävande: ett experiment kräver bara några timmars förberedelsetid, en kultur period på ungefär åtta dagar och några timmar i slutet av experimentet för avbildning och analys av data. Explantation elektroporation är också överlägsen-cellbaserade cis-reglerande analys sedan själva näthinnan vävnad utnyttjas. Näthinnan utvecklas helt normalt i Explantation kultur-den bildar tre olika cellulära lager (yttre kärnlagret, inre kärnkraft lager och ganglion cellager), även fotoreceptorer misslyckas med att utarbeta yttre segment.

En ytterligare fördel är att explantation elektroporation är mycket reproducerbar. Samma konstruktioner electroporated i olika näthinnor, även på olika dagar, oftast resulterar i samma relativa uttryck nivåer. Eftersom det electroporated plasmider tros hållas episomally i kärnan och är inte införlivas i kromosomerna, verkar de inte vara föremål för samma effekter integration webbplats som PLÅGA cis-reglerande analys i transgena möss.

Explantation elektroporation har flera begränsningar. Först kan bara celler som fortfarande befinner sig i cellcykeln vara effektivt transduced av elektroporation ^15. På P0, växelstag och andra senare födda näthinnan celltyper (bipolär celler, amakrina celler, M ller Glia) är de viktigaste cellpopulationer måltavla för denna metod. Elektroporation av kon fotoreceptorer som P0 elektroporation har rapporterats ¹⁶ men effektiviteten förefaller vara låg. En andra begränsning är att explantation kultur bortom två veckor resulterar i progressiv missbildning av näthinnan och rekommenderas därför inte. Om promotor kvantifiering krävs vid sena tidpunkter kan dock en in vivo-elektroporering ⁹ utföras, följt av retinala dissektion på önskad tidpunkterna, platt-montering av dissekeras näthinnan, och kvantifiering som beskrivs i avsnitt 9. En tredje begränsning är att denna analys är endast måttligt hög genomströmning. Till skillnad baserad kultur cell analyser som kan testa hundratals konstruktioner i ett enda experiment kräver teknik som beskrivs i detta protokoll minst en hel mus näthinnan per konstruktion. Därmed kan endast ett par dussin konstruerar skäligen kan electroporated på en dag.

Ytterligare en nackdel med avseende på kvantifiering av promotor aktivitet med hjälp av den nuvarande modellen är att det finns en potential för "genomblödning" av DsRed fluorescens i GFP-kanal, speciellt när testmetoder mycket stark initiativtagare. Anledningen till detta är att utsläppen spektrum av DsRed överlappar delvis av GFP. För att kringgå detta problem bör optimeras utsläpp filter användas som minimerar den spektrala överlappningen mellan DsRed och GFP. När sådana optimerade filter sätter inte är tillgängliga, skulle en annan möjlig lösning vara att använda en blå-skiftat fluorescerande protein (t.ex. BFP eller GFP) i stället för GFP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electroporation dish, Microslide 453	BTX Technologies	45-0105	See protocol section 1 for modifications
100% silicone rubber aquarium cement	Perfecto Manufacturing
Plastic microtube rack	Fisher Scientific	05-541	Only the rack handle will be used
Dremel tool			For cutting the handle off the plastic tube rack
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11965
F12	GIBCO, by Life Technologies	11765
L-Glu/pen/strep	GIBCO, by Life Technologies	10378-016	100X concentration
Insulin	Sigma-Aldrich	I-6634	For 1000X stock, resuspend at 5mg/ml in 5mM HCl and filter-sterilize
FBS	GIBCO, by Life Technologies	26140-079
ECM 830 Square-wave electroporator	BTX Technologies
Nuclepore filters	Whatman, GE Healthcare	110606	25mm, 0.2μm
Tissue culture incubator			37°C, 5% CO2
Glass coverslips #1.5	Fisher Scientific	12-544E	0.16mm thick
Fluorescent compound microscope equipped with camera			Camera should be monochromatic (e.g., ORCA-ER camera by Hamamatsu)
EGFP/DsRed filter set for compound microscope	Chroma Technology Corp.	86007	This filter set minimizes bleedthrough between the red and green chanenels
ImageJ Software	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/