הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

Summary

שיטה זו מתארת ​​כיצד לנתח ולהעריך התפתחות תפקוד בלוטת החלב ומן העכברים. בלוטות החלב נכרת מוערכים לתואר הפיתוח באמצעות הר שלם תוך פליטה החלב מוערך באמצעות אוקסיטוצין מבוססי assay myoepithelial התכווצות התא.

Abstract

בלוטת החלב האנושי מורכב האונות 15-20 כי חלב מפרישים לתוך הפתח הסתעפות מערכת צינור לעבר הפטמה. אונות אלו הן עצמם מורכבת ממספר יחידות מסוף אונתית צינור עשוי alveoli הפרשה ותעלות מתכנסים ^1. בעכברים, ארכיטקטורה דומה שנצפה הריון שבו צינוריות ו alveoli משובצים בתוך stroma רקמת החיבור. אפיתל עכבר בלוטת החלב הוא עץ כמו מערכת של צינורות מורכב משתי שכבות של תאים, השכבה הפנימית של תאים luminal מוקף שכבה חיצונית של תאים myoepithelial כונה על ידי לגבולות קרום המרתף ^2. בזמן הלידה, רק עץ ductal rudimental קיים, המורכב סניפים הדביק 15-20 העיקרי. סניף התארכות ולהתחיל הגברה בתחילת גיל ההתבגרות, סביב 4 שבועות, תחת השפעה של הורמונים ^3,4,5. ב 10 שבועות, רוב stroma הוא פלש ידי מערכת מורכבת של צינורות כי יעברו מחזורים של הסתעפות ונסיגה כל מחזור הייחום עד ההריון ^2. עם תחילת ההריון, השלב השני של הפיתוח מתחיל, עם התפשטות והבחנה של אפיתל ליצירת ענבים בצורת הפרשה חלב מבנים קרא alveoli ^6,7. לאחר הלידה ובמהלך ההנקה, החלב מיוצר על ידי תאים הפרשה luminal ו מאוחסן בתוך לומן של alveoli. לשחרר אוקסיטוצין, מגורה על ידי רפלקס עצבי המושרה על ידי היניקה של הגורים, גורמת להתכווצויות מסונכרן של תאים myoepithelial סביב alveoli לאורך צינורות, המאפשר חלב להיות מועבר דרך הצינורות אל הפטמה שבה הוא הופך להיות זמין עד ⁸ ​​גורים. התפתחות בלוטת החלב בידול, ותפקוד הם דורשים מתוזמר היטב, לא רק אינטראקציות בין stroma את האפיתל, אך גם בין תאים myoepithelial ו luminal בתוך האפיתל ^9,10,11. ובכך, מוטציות בגנים רבים מעורבים אינטראקציות אלה עלולים לפגוע גם התארכות ductal במהלך היווצרות ההתבגרות או alveoli במהלך ההריון התמיינות מוקדם במהלך ההריון המאוחרות ההפעלה הפרשה המוביל הנקה ^12,13. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לנתח בלוטות החלב עכבר ולהעריך את התפתחותם באמצעות mounts כולו. אנחנו גם מדגימים כיצד להעריך התכווצויות myoepithelial ואת פליטת חלב באמצעות לשעבר vivo אוקסיטוצין מבוססי assay תפקודית. ההשפעה של מוטציה בגן על התפתחות בלוטת החלב לתפקד ולכן יכול להיקבע באתרו על ידי ביצוע שתי הטכניקות הללו בעכברים מוטציה מלאה ו wild-type.

Protocol

1. בלוטת החלב לנתיחה

1. להרדים את העכבר באמצעות שאיפת CO _2. הימנע נקע בצוואר הרחם אם אפשר שכן הוא עלול לפגוע בכלי הדם הגדולים בצוואר לגרום להצטברות של דם סביב בלוטות החלב, עיבוד לנתיחה קשה יותר. עם זאת, אם קריטריונים אחרים יש להעריך אותו עכבר, כגון רמות של אוקסיטוצין, שיטות המתת חסד חלופי עשוי להיות נחוץ, אם כי זה צריך להיות מוערך על ידי IACUC שלך.
2. על קצף פוליסטירן עטופה בנייר, במקום את העכבר על גבו ולהפיץ את ארבעת הגפיים. הצמד בחוזקה את כל ארבעת הגפיים באמצעות 16-20 מחטים מד (איור 1A).
3. תרסיס העכבר בנדיבות עם אתנול 70%.
4. בעזרת מלקחיים, למשוך את העור בבטן בכל קו האמצע ולעשות חתך קטן במספריים חדים.
5. החל מ החתך, לחתוך את העור עד הצוואר של החיה תוך הימנעות ניקוב החללים הבטן או החזה (איור 1B).
6. חותכים את העור על הרגליים הקדמיות על החתך קו האמצע, וכתוצאה מכך "צורת Y" (איור 1B). חותכים את העור של הגפיים האחוריות באותה דרך (איור 1B).
7. בעזרת מלקחיים עוצר דמום, לקלף בעדינות את העור של הבטן החזה בצד של העכבר. במידת הצורך, בעדינות לחתוך רקמות מקשר.
8. תקן את העור באמצעות קצף פוליסטירן 16-20 מחטים מד, לחשוף את בלוטות החלב המצורפת התחתון של העור. המשך והשלמה צד אחד בכל פעם (תרשים 1C).
9. בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים את בלוטת החלב עניין לחתוך בין בלוטת ואת העור במספריים חדות קטן, החל מבחוץ לכיוון עמוד השדרה של החיה. הקפד לחתוך בזהירות, כדי לא פיסות עור או שריר להישאר על בלוטת. בלוטות החלב כל (איור 1) ניתן להסיר באמצעות פרוטוקול זה, אבל בלוטות החלב בטן (מס '4) הם הטובים ביותר עבור כל הרכבה. ^Nd 2 ו 3 בלוטות ^rd יש שרירים interdigitated ובעוד הם יכולים לשמש הר היסטולוגיה כולו, הם עלולים שלא להתאים לכל מנתח.

2. שלמה הר

1. לפחות יום אחד לפני לנתיחה, להכין פתרון ארגמן אלום ידי המסת 1g של ארגמן ו 2.5G של אלומיניום סולפט אשלגן 500 מ"ל מים מזוקקים להרתיח במשך 20 דקות בתוך בקבוק 1 ליטר Erlenmeyer. התאמת עוצמת השמע הסופי 500 מ"ל מים. סינון דרך נייר Whatman ולהוסיף כמות קטנה של תימול (גרגרי) כחומר משמר. מכניסים למקרר. לאחר צביעה, פתרון ארגמן אלום ניתן שפכו בחזרה בקבוק המניות ולעשות בהם שימוש חוזר פעמים רבות על פני מספר שבועות. בצע פתרון טרי כאשר צבע הופך קלוש.
2. לאחר גוזמות את בלוטת החלב של העכבר (שלב 1), להפיץ אותו ישירות על זכוכית שקופית. נסה לשטח אותו ככל האפשר, תוך שמירה על צורתו המקורית באתרה. בלוטת ידבק בשקופית יפה כאשר נמתח כראוי.
3. תקן את בלוטת ידי טבילה זה, בשקופית, ב מקבע של Carnoy (100% EtOH, כלורופורם, חומצה אצטית קרחונית; 06:03:01) במשך 4 שעות בשכונה קטר בטמפרטורת החדר בצנצנת. שים לב ואחרים השתמשו 2 שעות אשר נראה מספיק. לחלופין, בלוטות יכול להיות גם קבוע 4 ° C למשך הלילה.
4. לשטוף באתנול 70% במשך 15 דקות. ואז, בהדרגה רעננותם במים על ידי הסרת מחצית הפתרון אתנול מצנצנת והחלפתו DDH ₂ O. דגירה של 5 דקות. חזור 3 פעמים. לחלופין, השתמש ב -70% - 35% -, 15% - אמבטיות אתנול ומים במשך 5 דקות כל אחד.
5. שטפו במים מזוקקים למשך 5 דקות.
6. כתם אלום ארגמן לילה בטמפרטורת החדר. יצוין כי מכתים עשויה להימשך זמן רב בהתאם לעובי של בלוטת.
7. הסר אלום ארגמן כתם על שימוש חוזר בהדרגה מייבשים רקמה צבעונית באמצעות אמבטיות אתנול סדרתי (50%, 70%, 95%, 100%) במשך 5 דקות כל אחד וברור קסילן, או חלופה רעיל כמו histo, ברור, בן לילה. גם התייבשות עלולה גם דורשים ניקוי incubations כבר עם דגימות עבה.
8. בלוטת החלב לטבול salicylate מתיל. בלוטות החלב יכולים להישמר salicylate מתיל במנדף קטר עד דימויים מוכנים לקחת.
9. דמויות יכולות להילקח במנדף קטר עם מצלמה דיגיטלית רגילה ממוקם על חצובה (שימוש בפונקציה "מאקרו" אם קיים), על ידי הצבת את השקופיות על שולחן אור. שימוש במיקרוסקופ לנתח עבור ההגדלה גבוה יותר. לחלופין, בלוטות החלב יכול להיות מותקן בכלי התקשורת כגון Permount (לאחר שלב 2.7) המאפשר תמונות להילקח מחוץ למכסה המנוע כימי עשן על כל פלטפורמה הדמיה מתן mounts הם דקים מספיק.
10. על מנת לכמת את התפתחות בלוטת החלב באמצעות הר שלמה, מדידות כגון מספר השלכות (או תופעות סניפים) לאורך חלקים של הצינורות, את אורך הצינורות העיקרי, או יחס של אפיתל לאזור רקמת שומן יכולה להעריך. לבסוף, לאחר documen הצילום, סימטרייה הר בלוטת החלב כולו יכול להיות מוטבע פרפין עבור חתך והכתים היסטולוגית קונבנציונאלי.

3. אוקסיטוצין-Induced חלב פליטה

1. הפרד את הגורים מן הסכר רק לאחר שהם כבר נמאס. חכו 1 שעה לפני ביצוע assay.
2. הקורבן האם לחשוף את בלוטות החלב כפי שתואר קודם לכן (שלבים 1.1-1.8), מבלי להסיר אותם מן החיה.
3. הפעל את assay באופן שווה על ידי הפלה או PBS או פתרון אוקסיטוצין ישירות על בלוטת החלב של עניין, בעזרת פיפטה ההעברה. ספקטרום רחב של מנות יכול לשמש; ~ 8 pg / ml (מנה פיזיולוגיים) משמש בדרך כלל. עם זאת, גבוהה שאינם מינונים פיזיולוגיים (עד 1 מ"ג / מ"ל) ניתן להשתמש כדי להבטיח את העדר התגובה מודלים עכבר מהונדס גנטית. עבור הליך זה, מומלץ להשתמש החזי (# 03/02) בלוטות, באמצעות צד אחד כביקורת (חשופים PBS) ואת הצד השני כדי לבדוק פליטה חלב (חשיפה אוקסיטוצין).
4. דגירה דקה 1 ולהסיר את הפתרון על ידי בקפידה aspirating אותו עם טפטפת ההעברה. כניסה חלב לתוך הצינורות ניתן לנטר באמצעות הקלטת וידאו, או על ידי לקיחת תמונות לפני ואחרי החשיפה PBS או אוקסיטוצין.

4. נציג תוצאות:

בהר שלמה טובה, בלוטת החלב היא התפשטה יפה הצינורות האפיתל הם נצפות בקלות (איור 2 א). אם בלוטת אינו היטב להתפשט, זה יכול להרים בחלקו או לחלוטין שקופית כאשר הניח הפתרון מקבע. בלוטת יהפוך קשה שמיש (2B איור). באופן דומה, אם הבלוטה לא גזור טוב, או חלק האפיתל יכול להיות חסר (איור 2C) או שאר חלקי העור או שרירי הבטן יפריע ניתוח של בלוטת (איור 2 ד).

עבור assay אוקסיטוצין, חשוב להפריד את הגורים יונק מן הסכר עבור אותה כמות של זמן בכל הזדמנות. בדרך זו תוכלו לוודא כי אין חלב או כמויות קטנות של חלב קיים הצינורות לפני החשיפה אוקסיטוצין, אבל גם זה מספיק חלב קיים alveoli שיכול להפלט לתוך הצינורות על ידי התכווצויות myoepithelial (איור 3A) . אם הגורים יוסרו מוקדם מדי, חלב יכול לצבור את alveoli ועל הצינורות טיוח את ההשפעה של אוקסיטוצין קשה לעקוב (איור 3B). לחילופין, אם הניסוי מבוצע מוקדם מדי לאחר הסרת הגור, חלב לא יהיה לך זמן לצבור את alveoli אוקסיטוצין ו-Induced התכווצויות של תאים myoepithelial לא יפעילו לשחרר מספיק חלב לתוך הצינורות כדי לצפות (איור 3 ג).

באיור 1. לנתיחה עכבר בלוטת החלב. הצמד את העכבר על גבו על ידי ארבעת הגפיים (A). חותכים את העור הראשון מתוך הבטן עד צוואר. ואז לעשות חתכים בניצב ממרכז הבטן אל כל איבר, כפי שמוצג ע"י הקו המקווקו (B). לקלף בעדינות את העור בצד של החיה ומהדקת אותו, לחשוף את בלוטות החלב (C).

2. איור עכבר כל בלוטת החלב הר. צינוריות אפיתל (חיצים) ואת הלימפה (ראש חץ) הם נצפו בקלות בהר להפיץ יפה בלוטת החלב שלמה של בלוטת # 4 (א). בלוטת החלב התפשטות לקוי עלול להיות מנותקת לשקופית והתמוטט, טיוח זה לא שמיש (B). בלוטת החלב נכרת שלא כדין יכולים להיות חלקים חסרים (ג) או פיסות עור או שריר הנותרים (ד '). שים לב ^nd 2 ו 3 בלוטות ^rd יש interdigitated שרירים, אבל עדיין יכול לשמש הר כולו או היסטולוגיה.

איור 3. אוקסיטוצין-Induced פליטה חלב ניתן לצפות צינוריות אפיתל (חיצים) בעקבות חשיפת אוקסיטוצין (A). עם זאת, אם הצינורות מלאים כבר בתחילת assay בשל תקופה ארוכה של חביון הולם אחרי האחרונה של יונק את הגורים, הצטברות נוספת של חלב בתוך הצינורות (חיצים) לאחר החשיפה אוקסיטוצין עם חלב (חיצים) קשה לצפות (B). לחילופין, תקופת חביון קצר לאחר הגור יונק לא יאפשר צבירת מספיק חלב לתוך alveoli כדי לצפות כראוי אחרי חשיפה אוקסיטוצין (ג) את צינוריות (חיצים). תמונות שנלקחו לפני ואחרי החשיפה אוקסיטוצין באמצעות מצלמה מספרי (Cybershot, סוני).

איור 4. ייצוגים סכמטי של כל מבחני טיפול גובר אוקסיטוצין.

Discussion

התפתחות בלוטת החלב הם פונקציה מתוזמר היטב. עכברים Mutant עשוי הנמל מוטציות גנטיות שיכולות לפגוע בהתפתחות בלוטת החלב לתפקד הדגשת הצורך להעריך ארכיטקטורה בלוטת ^13,12. הרכבה שלם ניתן לבצע כפי שמתואר במאמר זה בכל שלבי התפתחות בלוטת החלב. בדרך כלל, פיתוח של האפיתל נבחנת בתחילת גיל ההתבגרות (~ 4 שבועות), בעיצומו של גיל ההתבגרות (~ 6 שבועות) ואחרי גיל ההתבגרות (~ 10-12 שבועות) ^2,10. בשלבים אלה, בסכום של צינור הסתעפות, במספר סוף ניצנים מסוף אורך הצינורות ניתן לקבוע על מנת לכמת את מידת ההתפתחות בלוטת ^14,15. באופן דומה, alveologenesis (פיתוח alveoli במהלך ההריון) נקבעת בדרך כלל במהלך ההריון ב 2-3 נקודות; השינויים המבניים המתרחשים במהלך ההנקה ואת לפוף יכול להיות גם ציין לכמת כולה בלוטת ההכנות הר ^16. אולם, כימות mounts כל מעכברים בהריון מניקות מאוחר יכול להיות קשה בשל צפיפות של הרקמה. מומלץ לשלב הר שלם עם מנתח היסטולוגית, במיוחד עבור אלה שלבי ^12. לקבלת הערכה היסטולוגית מפורט יותר, בלוטות החלב ניתן להסיר באמצעות פרוטוקול אותו ציין בדוח זה, קבוע בפורמלין נתון hematoxylin והכתים eosin. הר שלם יכול להיות גם פרפין מוטבעים המשמשים היסטולוגיה פעם הדמיה שבוצעה. במשך שתי טכניקות, דיסקציה נכונה העדין של בלוטות החלב הוא קריטי. אם עכברים מוטנטים נמצאים העריכו, חשוב להשוות בין אלה עכברים העכברים לשלוט הקרוב האפשרי, שכן זנים שונים העכבר יכול להראות צד או משתנה שלישוני, השלכות, או alveologenesis ^17. למשל, כאשר לעומת BALB / c עכברים, עכברים C57BL / 6 מפגינים בצד הסתעפות מופחת alveologenesis ^17,18. לכן, BALB / c עכברים לא אמור לשמש כביקורת על עכברים מהונדסים גנטית שנוצר על רקע C57BL / 6 העכבר. בעוד הרכבה שלם מספק תובנה ליקויים התפתחותיים ברוטו, את הפונקציה של בלוטת החלב עשוי גם צורך להעריך באמצעות טכניקות משלימות אחרות.

עיקר תפקידם של בלוטת החלב היא לייצר ולספק חלב גורים. תהליכים אלה דורשים לא רק התמיינות תקינה של תאים הפרשה luminal במהלך ההריון, אך התכווצויות לתאם גם ויעיל של תאים myoepithelial סביב alveoli ולאורך הצינורות להובלת חלב ^8. בעוד ייצור החלב ואיכות ניתן להעריך על ידי הערכה אנליטית של הרכב חלב ^12, בין היתר, את הסיבות משלוח חלב לקוי של גורים קשה יותר להעריך. ואכן, בהיעדר נצפתה חלב הבטן של גורים שזה עתה נולדו ניתן לקשר פגמים רבים כגון ייצור החלב לקוי, חוסר היכולת של הגורים לינוק, פגמים התנהגותיים של האם או פליטה פגמים חלב. אחת הדרכים להעריך התחבורה חלב פגמים פליטה מן alveoli לתוך צינוריות היא לגרום להתכווצויות myoepithelial באמצעות אוקסיטוצין, כפי שתוארו במאמר זה. אולם, כימות התחבורה חלב פליטה קשה מאז את ההשפעה של אוקסיטוצין לשעבר vivo מהירה (בדרך כלל חלב ניתן לצפות הצינורות בתוך דקה 1 אחרי חשיפה), גם בעת שימוש במינון נמוך של אוקסיטוצין פיזיולוגיים ^10. לכן, ההבדל קלה היעילות של פליטה חלב בין שני קווים העכבר לא יכול להיות הנצפה באמצעות טכניקה זו. כימות זה תגובה קשה אבל אף אחד וכמותיות דרך להעריך אוקסיטוצין-Induced פליטה חלב היא לבחון את התגובה תחת מגוון רחב של מינונים, ולקבוע את זמן הטיפול הדרוש כדי למלא את צינוריות חלב. . בכל המקרים, עקביות תקופת ההמתנה בין הגור יונק האחרון לתחילת assay הוא קריטי. עבור כימות מדויק יותר של הנקה או זיהוי פגם פליטה חלב, בשיטה זו ניתן כהשלמה וכימות של חלבונים חלב מסלולי איתות, כגון β-וקזאין ו Stat5, בהתאמה, או התכווצות תאים במבחנה myoepithelial בחשיפה אוקסיטוצין ¹⁹ .

לסיכום, מודלים עכבר מהונדס חשובים בשימוש נרחב לחקר תפקוד בלוטת החלב ואת הפיתוח, ולהעריך את התפקיד של גנים מפתח בתהליכים אלה. הארכיטקטורה של האפיתל בלוטת החלב ניתן להבחין בקלות בבלוטות נכרת כראוי באמצעות הר שלם בכל שלבי הפיתוח. למרות פגמים הנקה המוביל תזונה גורים יכולים להיות מקורות רבים, חסר של פליטה חלב ניתן להעריך על ידי התכווצות אוקסיטוצין-Induced מסונכרן של תאים myoepithelial באתרם. יחד, שתי טכניקות (איור 4) יכול לתת תובנות חשובות ההשפעה של גנים ספציפיים mutations או מחיקות על התפתחות תפקוד בלוטת החלב ו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Thymol	Sigma-Aldrich	T0501
Methyl salicylate	Sigma-Aldrich	M6752
Oxytocin	Sigma-Aldrich	O3251