乳腺的发育和功能在小鼠模型的评价

Summary

这种方法介绍如何剖析和评估小鼠乳腺发育和功能。切除乳腺评估使用全挂载的发展程度，而牛奶弹射使用催产素为基础的肌上皮细胞收缩测定评价。

Abstract

15-20叶组成的人体乳腺分泌乳汁，到乳头管系统开放的一个分支。这些叶是自己的终末导管小叶分泌肺泡和融合的管道¹单位组成。在小鼠实验中，观察到类似的架构在怀孕管道和肺泡内的结缔组织基质中穿插。小鼠乳腺上皮细胞是像由两层细胞，管腔细胞基底膜²的范围表示的肌上皮细胞的外层包围的内层组成的导管系统树。出生时，只有残留的导管树目前，主风管和15-20分支机构组成。伸长率和放大分公司开始在青春期的开始，4周龄左右^，3,4,5激素的影响下。在10个星期，大部分基质入侵的管道由一个复杂的系统，将发生在每个发情周期，直到^怀孕 2分支和回归周期。在怀孕开始，开始第二阶段的发展，与上皮细胞的增殖和分化形成葡萄状的牛奶分泌结构称为^肺泡 6,7的。整个分娩和哺乳，牛奶是生产管腔分泌细胞，并储存在肺泡腔内。催产素的释放，仔兔哺乳引起的神经反射刺激，诱导肺泡周围和沿导管的肌上皮细胞的同步收缩，让牛奶通过管道输送到乳头它成为可用的幼^崽 8 。乳腺的发育，分化和功能的紧密配合和要求，不仅基质和上皮细胞之间的相互作用，而且之间的肌上皮细胞和管腔内的^上皮细胞9,10,11。从而，在这些相互作用中有牵连的许多基因的突变可能会损害或者在妊娠晚期和分泌的^激活 ，导致泌乳12,13在青春期或肺泡在怀孕早期，分化形成导管伸长。在这篇文章中，我们描述了如何解剖小鼠乳腺和评估他们的发展，使用整个坐骑。我们还演示了如何评价肌上皮收缩和牛奶弹射使用前体内催产素的功能测定。对乳腺的发育和功能的基因突变的影响，因此可以在原地决定执行这两种技术在突变体和野生型对照组小鼠。

Protocol

1。乳腺淋巴清扫术

1. 安乐死的鼠标使用CO ₂吸入。如果可能，避免颈椎脱位，在颈部和乳腺周围的血液中积累的结果，因为它可能会损害大血管，使剥离更加困难。但是，如果其他条件，在相同的鼠标，如催产素的血药浓度，评估，替代安乐死方法可能是必要的，尽管这必须由您IACUC评估。
2. 在铝箔包裹的聚苯乙烯泡沫塑料，在它的后面放置鼠标和蔓延四肢。引脚牢固四肢使用16至20号针头（图1A）。
3. 鼠标慷慨地喷用70％乙醇。
4. 使用镊子，拉起在中线的腹部皮肤，使一个小切口锋利的剪刀。
5. 从切口，切开皮肤，动物的颈部，同时避免穿刺腹腔或胸腔（图1B）。
6. 切前肢正中切口的皮肤上，导致在一个“Y形”（图1B）。削减后方四肢皮肤相同的方式（图1B）。
7. 使用止血钳，轻轻剥离鼠标侧面的腹部和胸部的皮肤。如果需要，轻轻切开结膜组织。
8. 修复皮肤使用16至20表针，揭露附着到皮肤下面的乳腺聚苯乙烯泡沫塑料。进行和完成时间（图1C）一方。
9. 使用镊子，轻轻乳腺的利益和减少之间的腺体和皮肤用锋利的小剪刀，开始从外部对脊柱的动物。确保削减仔细，所以没有皮肤或肌肉，保持腺体。所有乳腺增生病（图1）可以使用此协议被删除，但腹部（＃4）乳腺是最佳的整体安装。 ^第二和^第三腺体一些叉的肌肉，虽然它们可以被用于整个安装和组织学，他们可能不适合于所有的分析。

2。整装

1. 至少一天前清扫，准备1G的胭脂红和2.5G的硫酸铝钾溶解在500毫升蒸馏水煮沸20分钟1升锥形瓶中胭脂红明矾溶液。调整最终体积500毫升水。筛选通过的Whatman纸，并添加少量的麝香草酚（几粒）作为防腐剂。冷藏。胭脂红明矾溶液染色后，可以倒出股票瓶，多次重复使用几个星期。颜色变得暗淡时，作出新的解决方案。
2. 鼠标（步骤1）乳腺切除后，直接在玻片上传播。尝试尽可能扁平化，使原来在原地形状。正确拉伸时，腺体会很好地坚持在幻灯片上。
3. 通风柜在一个罐子在室温4小时修复，在幻灯片上，沉浸在卡诺固定液（100％乙醇，氯仿，冰醋酸; 6:3:1）的腺体。请注意，其他人已经用了2小时，这似乎是足够的。此外，腺体也可以固定在4 ° C过夜。
4. 70％的乙醇洗为15分钟。然后，补充水分，水逐渐从JAR中删除一半的乙醇溶液和_取代DDH 2 O孵育5分钟。重复3次。另外，使用70％ - 乙醇和水的浴缸，每次5分钟 - 35％ - 15％。
5. 在蒸馏水冲洗5分钟。
6. 在室温下染色胭脂红明矾过夜。应该指出，染色可能需要更长的时间取决于腺体厚度。
7. 卸下胭脂红明矾染色重用，并逐步通过串行乙醇浴（50％，70％，95％，100％）脱水染色组织5分钟每二甲苯明确，或在一个无毒的替代，如组织明确，过夜。脱水和结算可能还需要较长的孵化较厚的样品。
8. 沉浸乳腺水杨酸甲酯。乳腺增生病，可以保持在通风橱中的甲基水杨酸，直到图像准备采取。
9. 图像可以在通风柜定位在三角架上（使用“宏”功能，如果有的话），放置一盏灯表的幻灯片，一个普通的数字相机。使用解剖显微镜高倍率。另外，乳腺增生病，可以安装在如Permount媒体（2.7步）后，允许采取任何成像平台提供的坐骑图片以外的化学通风柜足够薄。
10. 为了量化乳腺发育，使用整个安装，可以评估的后果（或分行）沿管道部分，主管的长度，或上皮脂肪组织的面积比等测量。最后，经过摄影documen仓储乳腺整装可以嵌入石蜡切片和常规病理染色。

3。催产素诱导的牛奶弹射

1. 分开后，他们被美联储大坝的幼崽。进行检测前，请等待1个小时。
2. 牺牲的母亲并没有消除他们从动物，暴露前（步骤1.1至1.8）所述的乳腺。
3. 开始均匀地下降，直接对利息乳腺PBS或催产素的解决方案，使用移液管的检测。可用于大范围的剂量;〜8 pg / mL的生理剂量通常用于。然而，非生理性的高剂量（1毫克/毫升），可以使用，以确保在转基因小鼠模型的情况下的响应。对于此过程，它是建议用胸（＃2-3）腺体，作为对照（暴露，以PBS）和对方的一个侧面测试牛奶射血分数（催产素曝光）。
4. 孵育1分钟，删除的解决方案，仔细用移液管吸。牛奶进入管道的入口可以监控录制的录像带，或服用前后PBS或催产素曝光的图像。

4。代表性的成果：

在一个良好的整装，是很好的传播和乳腺上皮细胞的管道很容易观察到的（图2A）。如果腺体是没有得到很好的传播，它可以从幻灯片抬起放在固定液的一部分或全部。腺体就会变得硬而无法使用（图2B）。同样，如果没有很好地解剖腺，无论是一些上皮细胞的一部分可以失踪（图2C）或剩余部分的皮肤或腹部肌肉会干扰分析与腺体（图2D）。

对于催产素的检测，重要的是要分开大坝相同数量的时间对每一个场合哺乳仔兔。这样，您将确保没有牛奶或少量的牛奶是在管道催产素暴露之前中，也有足够的牛奶是可以弹出导管肌上皮收缩（图3A）在肺泡。如果幼崽过早地被删除，牛奶可以累积在肺泡和管道渲染催产素的效果难以监控（图3B）。另外，如果去除后小狗还为时过早实验，牛奶会不会有时间来积聚在肺泡和催产素诱导的肌上皮细胞收缩，不会触发到足够的牛奶被观察的管道（图3C）释放。

图1。小鼠乳腺清扫。在它的后面，四肢（一）引脚鼠标。剪下从腹部到颈部的皮肤。腹部中心，每个肢体虚线（二）所示，然后从垂直切口。一侧动物的皮肤上，轻轻地揭下针，露出了乳腺增生病（三）。

图2小鼠乳腺整个坐骑。上皮管（箭头）和淋巴结（箭头），很容易观察到一个很好的传播乳腺腺体全挂载＃4（一）。不善传播的乳腺有可能成为脱离幻灯片和折叠，使其无法使用（二）。不当切除的乳腺可以有缺少的部分（C）或肌肉或皮肤件，其余（四）。请注意第²次和³路腺体叉的肌肉，但仍然可以用于整个安装或组织学。

图3。催产素诱导牛奶弹射，可观察到上皮管（箭头），催产素曝光（一）。不过，如果管道已经在去年哺乳后的幼崽，进一步积累牛奶在管道接触后，催产素（箭头）的检测，由于不适当的长期延迟开始与牛奶（箭头）充满很难（二）观察。另外，短的潜伏期后，小狗的哺乳不会让牛奶足够的积累后，催产素曝光（三）妥善管（箭头）观察到肺泡。前和后叶催产素使用数字相机的曝光（CYBERSHOT，索尼）图像。

图4。整个安装和催产素治疗实验的示意图表示。

Discussion

乳腺发育和功能的紧密协调。突变小鼠中可能隐藏的基因突变，会损害乳腺的发育和功能，突出了需要评估^腺架构13,12。本文中描述的乳腺发育的各个阶段，整个安装可以执行。通常情况下，上皮细胞的发展是评估在青春期开始（〜4周龄），青春期（〜6周龄）中，进入青春期后（约10-12周龄^）2,10 。在这几个阶段，管分支的数量，可确定的末端芽和管道的长度以量化程度^的发育14,15。同样，alveologenesis（肺泡怀孕期间的发展）通常在2-3点确定，在怀孕期间，在整个装入^腺制剂16，发生在哺乳期和复旧的结构变化也可以被观察和量化。然而，从后期的孕妇和哺乳期的小鼠整体坐骑量化可以是困难的，由于组织的密度。这是建议，结合病理分析整装，尤其是对于^那些阶段12 ，。更详细的组织学评价，乳腺可以去掉，使用相同的协议，在这份报告中指出，在福尔马林固定，并以苏木精和曙红染色。整装也可以石蜡包埋和组织学用一次成像已执行。对于这两种技术，适当的和微妙的乳腺的解剖是至关重要的。如果突变小鼠正在评估，重要的是尽可能最接近的对照组小鼠比较这些老鼠，因为不同的小鼠品系，可以显示变量的副作用或三级^后果 ，或alveologenesis 17。例如，BALB / c小鼠相比，C57BL / 6小鼠表现出减少副作用分支和^{alveologenesis} 17,18 。因此，BALB / c小鼠，不应被用来作为在C57BL / 6小鼠的背景下产生的转基因小鼠的控制。虽然整个安装提供了总值发育缺陷的洞察力，乳腺的功能，可能还需要使用其他补充技术进行评估。

乳腺的主要职能是生产和交付牛奶幼仔。这些过程不仅需要在怀孕期间分泌管腔细胞的正常分化，但还协调和高效的收缩，周围的肺泡， ^沿运奶8导管的肌上皮细胞。虽然牛奶产量和质量可以由牛奶中的成分分析评估¹²评估，除其他外，幼 ​​崽的送奶受损的原因是难以评估。事实上，牛奶新生幼崽的肚子观察到的情况下，可以链接到许多缺陷，如牛奶产量受损，无法哺乳幼崽的母亲或牛奶弹射缺陷的行为缺陷。从肺泡进入管道评价牛奶的运输和弹射缺陷的方法之一，是诱发肌上皮收缩，使用催产素，如本文中所述。然而，牛奶的运输和射血分数量化是困难的，因为体内催产素的作用是快速的（通常是牛奶，可以在暴露后1分钟内观察到的管道），即使^使用低生理剂量催产素10。因此，在牛奶两个鼠标线之间的弹射效率略有差异可能不能使用这种技术观察。量化这种反应是很难的，但一个半定量评估催产素诱导牛奶弹射的方式，是研究各种不同的剂量下的反应，并确定治疗所需的时间，以填补与乳管。 。在所有情况下，等待周期之间的最后乳猪检测开始小狗的一致性是至关重要的。对于哺乳期或牛奶弹射缺陷识别更准确的量化，这种方法可以由牛奶蛋白和信号通路，如β-酪蛋白和STAT5，分别量化补充， 或在体外肌上皮细胞收缩后，催产素^曝光 19 。

综上所述，转基因小鼠模型为研究乳腺功能和发展是重要的，广泛使用，并评估在这些过程中的关键基因的作用。乳腺上皮细胞的结构可以很容易地观察到整个装载在发展的所有阶段使用的正确切除腺体。虽然哺乳仔兔营养不良导致的缺陷，可以有很多的起源，在牛奶弹射的不足，可以评估催产素诱导同步收缩肌上皮细胞原位。总之，这两个技术（图4）可以给特定的基因突变的效果的重要见解tions或乳腺发育和功能上的缺失。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Thymol	Sigma-Aldrich	T0501
Methyl salicylate	Sigma-Aldrich	M6752
Oxytocin	Sigma-Aldrich	O3251