Summary
Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.
Abstract
La glándula mamaria humana se compone de lóbulos 15-20 que secretan la leche en un sistema de apertura de ramificación del conducto en el pezón. Los lóbulos se compone de un número de unidades del terminal del conducto lobular hecho de los alvéolos secretores y conductos de convergencia 1. En ratones, una arquitectura similar se observa en el embarazo en la que los conductos y los alvéolos se intercalan en el estroma del tejido conjuntivo. El epitelio de la glándula mamaria del ratón es un árbol como el sistema de conductos compuesto por dos capas de células, una capa interna de células luminales rodeado por una capa externa de células mioepiteliales denotada por los confines de una membrana basal 2. Al nacer, sólo un árbol ductal rudimentario está presente, compuesto por un conducto de las ramas primarias y 15-20. Rama de elongación y empezar de amplificación en el comienzo de la pubertad, alrededor de 4 semanas de edad, bajo la influencia de las hormonas 3,4,5. A las 10 semanas, la mayoría de la estroma es invadido por un complejo sistema de conductos que se someten a ciclos de ramificación y de regresión en cada ciclo estral hasta el embarazo 2. En el inicio del embarazo, una segunda fase de desarrollo se inicia, con la proliferación y diferenciación del epitelio de uva para formar estructuras en forma de secreción de leche, llamados alvéolos 6,7. Siguientes al parto y durante la lactancia, la leche es producida por las células secretoras luminal y se almacena en el lumen de los alvéolos. La liberación de oxitocina, estimulada por un reflejo neural inducida por la lactancia de las crías, induce contracciones sincronizadas de las células mioepiteliales alrededor de los alvéolos y por los conductos, permitiendo que la leche que se transporta a través de los conductos hacia el pezón, donde esté disponible a los 8 cachorros. Desarrollo de la glándula mamaria, diferenciación y función están fuertemente orquestado y que requieren, no sólo las interacciones entre el estroma y el epitelio, sino también entre las células mioepiteliales y luminal del epitelio 9,10,11. Por lo tanto, las mutaciones en muchos genes implicados en estas interacciones pueden afectar tanto el alargamiento ductal durante la formación de la pubertad o los alvéolos durante el embarazo temprano, la diferenciación durante la última etapa del embarazo y la activación secretora que conduce a la lactancia 12,13. En este artículo se describe cómo diseccionar las glándulas mamarias de ratón y evaluar su desarrollo el uso de bases conjunto. También demostramos cómo evaluar las contracciones mioepiteliales y eyección de la leche con un ex-vivo oxitocina basado en análisis funcional. El efecto de una mutación genética en el desarrollo de la glándula mamaria y la función de lo que se puede determinar in situ mediante la realización de estas dos técnicas en el control de ratones mutantes y de tipo salvaje.
Protocol
1. Disección de la glándula mamaria
- Practicar la eutanasia con el ratón usando inhalación de CO 2. Evitar la dislocación cervical, si es posible, ya que puede dañar los vasos sanguíneos importantes en el cuello y el resultado de la acumulación de sangre alrededor de las glándulas mamarias, lo que hace la disección más difícil. Sin embargo, si otros criterios que se evaluarán en el mismo ratón, tales como los niveles de oxitocina, métodos alternativos de la eutanasia puede ser necesaria, aunque esto debe ser evaluado por su IACUC.
- En una espuma de poliestireno envueltos en papel de aluminio, colocar el ratón sobre la espalda y la propagación de las cuatro extremidades. Pin firmemente las cuatro extremidades con 16 a 20 agujas de calibre (fig. 1A).
- Rocíe el ratón generosamente con etanol al 70%.
- El uso de pinzas, tire de la piel del abdomen en la línea media y hacer una pequeña incisión con tijeras afiladas.
- A partir de la incisión, corte la piel hasta el cuello del animal y evitar la punción de la cavidad abdominal o torácica (fig. 1B).
- Cortar la piel de las patas delanteras de la incisión de línea media, lo que resulta en una "forma de Y" (fig. 1B). Cortar la piel de las extremidades traseras de la misma manera (fig. 1B).
- El uso de pinzas hemostáticas, pelar suavemente la piel abdominal y torácica en el lado del ratón. Si es necesario, con suavidad cortar el tejido conjuntivo.
- Fijar la piel a la espuma de poliestireno con 16 a 20 agujas de calibre, la exposición de las glándulas mamarias adjunta a la parte inferior de la piel. Continuar y completar un lado a la vez (fig. 1C).
- Con unas pinzas, levante suavemente la glándula mamaria de interés y reducir entre la glándula y la piel con pequeñas tijeras afiladas, a partir desde el exterior hacia la espina dorsal del animal. Asegúrese de que cortar cuidadosamente, de modo que ningún pedazo de la piel o los músculos permanecen en la glándula. Todas las glándulas mamarias (Figura 1) se pueden eliminar con este protocolo, pero abdominal glándulas mamarias (# 4) son los mejores para el montaje de todo. La 2 ª y 3 ª glándulas tener algunos músculos interdigitados y aunque se puede utilizar para montar todo y la histología, que podría no ser apropiado para todos los análisis.
2. Todo el montaje
- Al menos un día antes de la disección, preparar una solución de carmín alumbre por disolución de 1 g de carmín y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio en 500 ml de agua destilada y hervir durante 20 minutos en un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Ajustar el volumen final de 500 ml con agua. Filtrar a través de un papel Whatman y añadir una pequeña cantidad de timol (algunos granos) como conservante. Refrigerar. Después de la tinción, solución de carmín alumbre puede ser vertida de nuevo a la botella de valores y reutilizar muchas veces durante varias semanas. Prepare una solución fresca cuando el color se debilita.
- Después de extirpar la glándula mamaria del ratón (paso 1), se extendió directamente en un portaobjetos de vidrio. Tratar de aplanar la medida de lo posible, conservando el original en la forma in situ. La glándula se pega en la diapositiva muy bien cuando bien tirante.
- Fijar la glándula por inmersión, en la diapositiva, en el fijador de Carnoy (EtOH al 100%, cloroformo, ácido acético glacial, 06:03:01) durante 4 horas en la campana de extracción a temperatura ambiente en un frasco. Tenga en cuenta que otros han utilizado dos horas, que parece ser suficiente. Por otra parte, las glándulas también puede ser fijado a 4 ° C durante la noche.
- De lavado en etanol al 70% durante 15 min. Luego, poco a poco rehidratar con agua mediante la eliminación de la mitad de la solución de etanol a partir de la jarra y su sustitución por ddH 2 O. Incubar durante 5 min. Repetir 3 veces. Por otra parte, el uso del 70% - 35% - 15% - baños de etanol y agua durante 5 minutos cada uno.
- Enjuague con agua destilada durante 5 minutos.
- Mancha de carmín alumbre en la noche a temperatura ambiente. Cabe señalar que la tinción puede tomar más tiempo, dependiendo del grosor de la glándula.
- Quitar manchas de carmín alumbre a la reutilización y poco a poco se deshidratan tejidos teñidos a través de baños de etanol de serie (50%, 70%, 95%, 100%) durante 5 minutos cada uno y aclarar en xileno, o en una alternativa no tóxica, como Histo-claro, durante la noche. Tanto la deshidratación y la limpieza también se puede requerir más tiempo incubaciones con muestras más gruesas.
- Glándula mamaria sumergirse en salicilato de metilo. Las glándulas mamarias se puede mantener en salicilato de metilo en una campana de extracción hasta que las imágenes están listas para tomar.
- Las imágenes pueden ser tomadas en una campana de humos con una cámara normal digital, colocada en un trípode (uso de "macro" función de si está disponible), mediante la colocación de las diapositivas en una mesa de luz. Utilizar un microscopio de disección de un aumento mayor. Por otra parte, las glándulas mamarias se puede montar en los medios de comunicación como Permount (después del paso 2.7) que permite imágenes que deben tomarse fuera una campana para sustancias químicas en cualquier plataforma de imágenes proporciona las monturas son lo suficientemente delgada.
- Con el fin de cuantificar el desarrollo de la glándula mamaria con montaje en general, medidas tales como el número de ramificaciones (o ramas laterales) a lo largo de porciones de los conductos, la longitud de los conductos principales, o sea una proporción de células epiteliales a la zona de tejido adiposo podrían ser evaluados. Finalmente, después de documentación fotográficación, montaje de toda la glándula mamaria puede ser embebido en parafina para el corte y tinción histológica convencional.
3. Inducidas por la oxitocina de eyección de leche
- Separar las crías de la madre justo después de que han sido alimentados. Espere una hora antes de realizar el ensayo.
- Sacrificio de la madre y exponer las glándulas mamarias como se describió anteriormente (pasos 1,1 a 1,8), sin necesidad de sacarlos de los animales.
- Iniciar el ensayo de caída uniformemente PBS o la solución de oxitocina directamente en la glándula mamaria de interés, utilizando una pipeta de transferencia. Un amplio espectro de dosis se puede utilizar; ~ 8 pg / ml (dosis fisiológicas) se utiliza normalmente. Sin embargo, la alta dosis no fisiológica (hasta 1 mg / ml) se puede utilizar para garantizar la ausencia de respuesta en modelos de ratón modificados genéticamente. Para este procedimiento, se recomienda el uso de tórax (# 2-3) glándulas, utilizando un lado como un control (en contacto con PBS) y el otro lado para poner a prueba la eyección de leche (la exposición de oxitocina).
- Incubar durante 1 minuto y retirar la solución cuidadosamente aspiración con una pipeta de transferencia. Entrada de la leche en los conductos se puede controlar mediante la grabación de cintas de vídeo, o por la toma de imágenes antes y después de la exposición PBS o la oxitocina.
4. Los resultados representativos:
En un montaje de todo bien, la glándula mamaria está bien extendido y epitelio de los conductos son fácilmente observables (Figura 2A). Si la glándula no es muy extendido, que puede levantar en parte o totalmente de la diapositiva cuando se coloca en la solución fijadora. La glándula se convertirá en duro e inutilizable (Figura 2B). Del mismo modo, si la glándula no está bien diseccionado, ya sea una parte del epitelio pueden estar ausentes (Figura 2C) o resto de las partes de la piel o el músculo abdominal puede interferir con el análisis de la glándula (Figura 2).
Para el ensayo de la oxitocina, es importante separar las crías lactantes de la presa por la misma cantidad de tiempo en cada ocasión. De esta manera, usted se asegurará de que ninguna leche o pequeñas cantidades de leche está presente en los conductos antes de la exposición de oxitocina, pero también que suficiente leche está presente en los alvéolos que se puede expulsar a los conductos por las contracciones mioepiteliales (Figura 3) . Si los cachorros se retiran demasiado pronto, la leche puede acumularse en los alvéolos y en los conductos de la representación del efecto de la oxitocina difícil de controlar (Figura 3B). Alternativamente, si el experimento se realiza demasiado pronto después de la eliminación crías, la leche no tendrá tiempo para acumularse en los alvéolos y la oxitocina inducida por las contracciones de las células mioepiteliales no provocar la liberación de suficiente cantidad de leche en los conductos que se observó (Figura 3C).
Figura 1. Disección de la glándula mamaria del ratón. Pin con el ratón sobre la espalda de las cuatro extremidades (A). Cortar la piel en primer lugar desde el vientre hasta el cuello. A continuación, hacer incisiones perpendiculares del centro de la barriga a cada miembro, como se muestra en la línea de puntos (B). Con cuidado, vaya de la piel en el lado de los animales y el pin, la exposición de las glándulas mamarias (C).
Figura 2. Glándula mamaria del ratón montar todo. Conductos de epitelio (flechas) y los ganglios linfáticos (cabeza de flecha) se observan con facilidad en un montaje de la glándula mamaria todo bien propagación de la glándula # 4 (A). Una glándula mamaria mal extendido pueden desprenderse de la diapositiva y se derrumbó, éste no podrá utilizarse (B). De la glándula mamaria o bien eliminado incorrectamente puede tener partes que faltan (C) o trozos de músculo o la piel restante (D). Tenga en cuenta que la 2 ª y 3 ª tienen glándulas interdigitados muscular, pero todavía se puede utilizar para todo el montaje o la histología.
Figura 3. Oxitocina inducida por la eyección de leche se puede observar en los conductos del epitelio (flechas) después de la exposición de oxitocina (A). Sin embargo, si los conductos ya están llenos de leche (flechas) en el comienzo de la prueba debido a un período de latencia inapropiada después de la última amamantamiento de las crías, una mayor acumulación de leche en los conductos (flechas) después de la exposición oxitocina es difícil observar (B). Por otra parte, un período de latencia corto después de las crías lactantes no permitir la acumulación suficiente de leche en los alvéolos para ser debidamente observada en los conductos (flechas) después de la exposición de oxitocina (C). Las imágenes fueron tomadas antes y después de la exposición de oxitocina con una cámara numérica (Cybershot, Sony).
Figura 4. Representaciones esquemáticas de los ensayos de tratamiento de todo el montaje y la oxitocina.
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Discussion
Desarrollo de la glándula mamaria y la función están muy orquestada. Los ratones mutantes pueden albergar las mutaciones genéticas que pueden afectar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de resaltar la necesidad de evaluar la arquitectura glándula 13,12. Montaje de todo se puede realizar como se describe en este artículo en todas las etapas de desarrollo de la glándula mamaria. Normalmente, el desarrollo del epitelio se aprecia en el comienzo de la pubertad (~ 4 semanas de edad), en el centro de la pubertad (unas 6 semanas de edad) y después de la pubertad (~ 10-12 semanas de edad) 2,10. En estas etapas, la cantidad de ramificaciones del conducto, el número de yemas terminales de final y la longitud de los conductos se puede determinar con el fin de cuantificar el grado de desarrollo de la glándula 14,15. Del mismo modo, alveologenesis (desarrollo de los alvéolos durante el embarazo) se determina generalmente a los 2-3 puntos durante el embarazo, los cambios estructurales que se producen durante la lactancia y la involución también pueden ser observadas y cuantificadas en su totalidad los preparativos de montaje glándula 16. Sin embargo, la cuantificación de los montes todo desde finales de los ratones embarazadas y lactantes, puede ser difícil debido a la densidad de los tejidos. Se recomienda combinar el montaje completo con análisis histológicos, especialmente para las 12 etapas. Para la evaluación histológica más detallada, las glándulas mamarias se puede eliminar con el mismo protocolo que se señala en este informe, fijados en formalina y se sometieron a tinción con hematoxilina y eosina. Todo el montaje también puede ser embebidos en parafina y se utiliza para el estudio histológico una imagen se ha realizado. Para ambas técnicas, la disección adecuada y delicada de las glándulas mamarias es crucial. Si los ratones mutantes se están evaluando, es importante comparar estos ratones a los ratones de control más cercano posible, ya que distintas cepas de ratón se puede mostrar la variable secundarios o terciarios ramificaciones, o alveologenesis 17. Por ejemplo, en comparación con los ratones Balb / c, C57BL / 6 presentan reducida lateral de las ramas y alveologenesis 17,18. Por lo tanto, ratones Balb / c no debe usarse como un control de ratones genéticamente modificados que sobre un fondo C57BL / 6 mouse. El montaje conjunto da una idea de graves defectos en el desarrollo, la función de la glándula mamaria que también tenga que ser evaluada utilizando otras técnicas complementarias.
La principal función de la glándula mamaria es la de producir y entregar la leche a los cachorros. Estos procesos requieren no sólo la diferenciación correcta de las células secretoras luminal durante el embarazo, sino también coordinar las contracciones y eficiente de las células mioepiteliales alrededor de los alvéolos y por los conductos para el transporte de leche 8. Mientras que la producción de leche y la calidad puede ser evaluada por la evaluación analítica de la composición de la leche 12, entre otras, las causas de deterioro de la entrega de leche a los cachorros es más difícil de evaluar. De hecho, la ausencia observada de la leche en los estómagos de los cachorros recién nacidos puede estar relacionado con muchos defectos, tales como la producción de leche con discapacidad, la incapacidad de los cachorros a mamar, defectos del comportamiento de la madre o los defectos de eyección de leche. Una forma de evaluar el transporte de leche y los defectos de expulsión de los alvéolos hacia los conductos es para inducir las contracciones mioepiteliales uso de oxitocina, como se describe en este artículo. Sin embargo, la cuantificación de transporte de la leche y la expulsión es difícil ya que el efecto de la oxitocina ex vivo es rápida (generalmente la leche se puede observar en los conductos de 1 minuto después de la exposición), incluso cuando se utilizan dosis bajas de oxitocina fisiológica 10. Por lo tanto, una ligera diferencia en la eficiencia de la eyección de la leche entre dos líneas de ratones no pueden ser observables con esta técnica. La cuantificación de esta respuesta es difícil, pero uno semi-cuantitativo de manera de evaluar la oxitocina inducida por la eyección de leche es el de examinar la respuesta en una variedad de dosis y para determinar el tiempo de tratamiento necesario para llenar los conductos de la leche. . En todos los casos, la consistencia del período de espera entre la última cría lactante hasta el comienzo de la prueba es crítica. Para una cuantificación más precisa de la lactancia o la identificación de un defecto de eyección de la leche, este método puede ser complementado con la cuantificación de las proteínas de la leche y las vías de señalización, como la β-caseína y STAT5, respectivamente, o en la contracción in vitro de células mioepiteliales en la exposición de oxitocina 19 .
En resumen, los modelos de ratones transgénicos son importantes y ampliamente utilizado para estudiar la función de la glándula mamaria y el desarrollo, y para evaluar el papel de los genes clave en estos procesos. La arquitectura del epitelio de la glándula mamaria se puede observar fácilmente en las glándulas extirpadas correctamente con montura completa en todas las etapas del desarrollo. Mientras que los defectos de lactancia conduce a la desnutrición cachorros puede tener muchos orígenes, una deficiencia en la eyección de la leche puede ser evaluada por la oxitocina inducida por la contracción sincronizada de las células mioepiteliales en el lugar. En conjunto, estas dos técnicas (Figura 4) puede dar pistas importantes sobre el efecto de la mutación específica del genciones o deleciones en el desarrollo de la glándula mamaria y la función.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Estos estudios fueron financiados por CIHR y becas CBCRA a DWL. IP fue financiado por becas de CIHR-STP, FRSQ y CIHR. MKGS fue financiado por becas OGS y CIHR STP. Los autores agradecen a Kevin Barr por su ayuda con la cría de ratón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
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