Summary
Deze methode beschrijft hoe te ontleden en te evalueren ontwikkeling van de borstklier en de functie van muizen. Weggesneden borstklieren zijn beoordeeld op de mate van ontwikkeling met behulp van ganse berg, terwijl melk ejectie is geëvalueerd met behulp van een oxytocine-based myo cel contractie assay.
Abstract
De menselijke borstklier is samengesteld van 15-20 lobben die scheiden melk in een vertakking kanalensysteem opening aan de tepel. Deze lobben zijn zelf samengesteld uit een aantal van de terminal kanaal lobulaire eenheden gemaakt van secretorische alveoli en convergerende kanalen 1. Bij muizen is een vergelijkbare architectuur waargenomen op de zwangerschap, waarin leidingen en alveoli worden afgewisseld binnen het bindweefsel stroma. De muis borstklier epitheel is een boom zoals systeem van kanalen bestaat uit twee lagen cellen, een binnenste laag van luminale cellen omgeven door een buitenste laag van de myo-epitheelcellen aangeduid door de grenzen van een basaal membraan 2. Bij de geboorte, slechts een rudimentaire ductaal boom aanwezig is, bestaat uit een primair kanaal en 15-20 takken. Branch verlenging en versterking beginnen bij het begin van de puberteit, op ongeveer 4 weken oud, onder invloed van hormonen 3,4,5. Op 10 weken, is het grootste deel van het stroma binnengedrongen door een complex systeem van kanalen dat de cycli van vertakking en regressie zal ondergaan in elk oestrische cyclus tot aan de zwangerschap 2. Bij het begin van de zwangerschap, een tweede fase van ontwikkeling begint, met de proliferatie en differentiatie van het epitheel te druif-vormige melk secretorische structuren, genaamd alveoli 6,7 vorm. Na de bevalling en in het geven van borstvoeding, wordt melk geproduceerd door luminale afscheidende cellen en opgeslagen in het lumen van de longblaasjes. Oxytocine release, gestimuleerd door een neurale reflex veroorzaakt door zogen van pups, induceert gesynchroniseerde contracties van de myo-cellen rond de alveoli en langs de kanalen, waardoor melk te vervoeren door de kanalen naar de tepel waar het wordt ter beschikking van de pups 8. Ontwikkeling van de borstklier, differentiatie en functie zijn strak georkestreerd en hebben, niet alleen interactie tussen de stroma en het epitheel, maar ook tussen myo en luminale cellen in het epitheel 9,10,11. Daarbij kunnen mutaties in vele genen betrokken zijn bij deze interacties aantasting ofwel ductaal rek tijdens de puberteit of alveoli vorming tijdens de vroege zwangerschap, differentiatie tijdens de late zwangerschap en secretorische activatie leidt tot het geven van borstvoeding 12,13. In dit artikel beschrijven we hoe u de muis melkklieren ontleden en beoordelen hun ontwikkeling met behulp van hele mounts. We hebben ook laten zien hoe myo contracties en melk uitwerpen met behulp van een ex-vivo oxytocine-gebaseerde functionele test te evalueren. Het effect van een genmutatie op de ontwikkeling van de borstklier en de functie kan dus worden bepaald in situ door het uitvoeren van deze twee technieken in mutant en wild-type controle muizen.
Protocol
1. Borstklier dissectie
- Euthanaseren van de muis met behulp van CO 2 inademing. Vermijd cervicale dislocatie, indien mogelijk, omdat het kan ernstige schade aan de bloedvaten in de nek en resulteren in accumulatie van bloed rond borstklieren, waardoor de dissectie moeilijker. Echter, als andere criteria moeten worden beoordeeld in dezelfde muis, zoals bloed niveau van oxytocine, kunnen alternatieve methoden euthanasie noodzakelijk zijn, maar dit moet worden beoordeeld door uw IACUC.
- Op een piepschuim verpakt in folie, plaatst u de muis op zijn rug en spreidde de vier ledematen. Pin stevig alle vier de ledematen met behulp van 16 tot 20 gauge naalden (Figuur 1A).
- Spray royaal de muis met 70% ethanol.
- Met behulp van een tang, trek de abdominale huid op de middenlijn en een kleine snede met scherpe schaar.
- Uitgaande van de incisie, snijd de huid tot aan de hals van het dier terwijl het vermijden van aanprikken van de buik of borstkas holten (figuur 1B).
- Snijd de huid op de voorpoten op de middellijn incisie, wat resulteert in een "Y-vorm" (Figuur 1B). Snijd de huid op de achterste ledematen op dezelfde manier (Figuur 1B).
- Met behulp van hemostatische tang voorzichtig schil de buik-en borstkas huid aan de zijkant van de muis. Indien nodig, zachtjes gesneden bindweefsel.
- Bevestig de huid om de polystyreen schuim met behulp van 16 tot 20 gauge naalden, waardoor de melkklieren aan de onderkant van de huid. Doorgaan en vult de ene kant in een tijd (figuur 1C).
- Met behulp van een tang, til de melkklier van rente en snijden tussen de klier en de huid met kleine scherpe schaar, vanaf de buiten naar de rug van het dier. Zorg ervoor dat u zorgvuldig knippen, zodat er geen stukjes huid of spier blijven op de klier. Alle melkklieren (Figuur 1) kan worden verwijderd met behulp van dit protocol, maar de buik borstklieren (# 4) zijn het beste voor de hele montage. De 2 e en 3 e klieren hebben een aantal interdigitated spieren en terwijl ze kunnen worden gebruikt voor de hele mount en histologie, ze misschien niet geschikt voor alle analyses.
2. Whole mount
- Ten minste een dag voor dissectie, voor te bereiden karmijn aluin-oplossing door het oplossen van 1 g van karmijn en 2,5 g van aluminium kalium sulfaat in 500 ml gedestilleerd water en kook gedurende 20 minuten in een 1 liter erlenmeyer. Pas het uiteindelijke volume tot 500 ml met water. Filtreer door een Whatman papier en voeg een kleine hoeveelheid thymol (enkele korrels) als conserveermiddel. Koel. Na het kleuren kan karmijn aluin oplossing terug te gieten om de voorraad fles en vele malen opnieuw gebruikt gedurende een aantal weken. Maak een verse oplossing als kleur wordt flauw.
- Na het weg te snijden van de uier van de muis (stap 1), direct spreid het op een glasplaatje. Probeer deze plat zoveel mogelijk behoud van de originele in situ vorm. De klier zal mooi plakken op de dia op de juiste wijze uitgerekt.
- Bevestig de klier door onderdompeling, op de dia, in fixatief Carnoy's (100% EtOH, chloroform, ijsazijn, 6:03:01) voor 4 uur in de zuurkast bij kamertemperatuur in een pot. Merk op dat anderen hebben twee uur die lijkt voldoende te zijn gebruikt. Als alternatief kan klieren ook worden vastgesteld op 4 ° C gedurende de nacht.
- Was in 70% ethanol gedurende 15 minuten. Dan, langzaam vocht opnemen in het water door het verwijderen van de helft van de ethanol-oplossing uit de pot en te vervangen door DDH 2 O. Incubeer gedurende 5 minuten. Herhaal dit 3 keer. U kunt ook 70% -, 35% -, 15% - ethanol en water baden voor elk 5 minuten.
- Spoelen in gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- 'S nachts vlek in karmijn aluin bij kamertemperatuur. Opgemerkt moet worden dat de vlekken langer zou kunnen duren, afhankelijk van de dikte van de klier.
- Verwijder karmijn aluin vlek te hergebruiken en geleidelijk gekleurd weefsel uitdrogen via seriële ethanol baden (50%, 70%, 95%, 100%) gedurende 5 minuten per stuk en duidelijk in xyleen, of in een niet-toxisch alternatief, zoals Histo-clear, 's nachts. Zowel de uitdroging en clearing kan ook vereisen een langere incubaties met dikkere monsters.
- Dompel borstklier in methylsalicylaat. Melkklieren kunnen worden bewaard in methylsalicylaat in een zuurkast pas beelden klaar om te worden genomen.
- Beelden kunnen worden genomen in een zuurkast met een gewone digitale camera geplaatst op een statief (gebruik "macro" functie indien beschikbaar), door het plaatsen van de dia's op een lichtbak. Gebruik een dissectiemicroscoop voor hogere vergroting. Als alternatief kan borstklieren worden gemonteerd in de media, zoals Permount (na stap 2.7), waardoor voor foto's worden genomen buiten een chemische dampkap op elk imaging platform het verstrekken van de mounts voldoende dun.
- Om de ontwikkeling van de borstklier met behulp van hele berg, metingen zoals het aantal vertakkingen (of zijtakken) langs gedeelten van de leidingen, de lengte van de primaire kanalen, of een verhouding van epitheliale naar vetweefsel gebied kan worden beoordeeld kwantificeren. Eindelijk, na fotografische documentatietatie, borstklier ganse berg kan worden ingebed in paraffine voor het snijden en conventionele histologische kleuring.
3. Oxytocine geïnduceerde melk ejectie
- Scheid de pups van de dam net nadat ze zijn gevoed. Wacht 1 uur voor het uitvoeren van de test.
- Offer de moeder en bloot de borstklieren zoals eerder beschreven (stappen 1.1 tot 1.8), zonder ze te verwijderen van het dier.
- Start de test door het gelijkmatig te laten vallen of PBS of de oxytocine oplossing direct op de melkklier van belang zijn, met behulp van een overdracht pipet. Een breed spectrum van doses kunnen worden gebruikt; ~ 8 pg / ml (fysiologische dosis) wordt typisch gebruikt. Toch kan een hoge niet-fysiologische doses (tot 1 mg / ml) worden gebruikt om de afwezigheid van respons in genetisch gemodificeerde muizen modellen te garanderen. Voor deze procedure, is het raadzaam om thoracale (# 2-3) klieren te gebruiken, waarbij de ene kant als een controle (blootgesteld aan PBS) en de andere kant de melk uitworp (oxytocine blootstelling) te testen.
- Incubeer gedurende 1 minuut en verwijder de oplossing door voorzichtig opzuigen met een transfer pipet. Melk de toegang tot de kanalen kan worden gevolgd door video-opnamen, of door het nemen van beelden voor en na PBS of oxytocine blootstelling.
4. Representatieve resultaten:
In een goede ganse berg, is de borstklier mooi te verspreiden en het epitheel kanalen zijn gemakkelijk te observeren (Figuur 2A). Als de schildklier is niet goed verspreid, kan het tot lift in gedeeltelijk of volledig uit de dia wanneer geplaatst in het fixeermiddel oplossing. De klier wordt dan hard en onbruikbaar (figuur 2B). Evenzo zal als de klier is niet goed ontleed, ofwel een deel van het epitheel kan ontbreken (figuur 2C) of de overige delen van de huid of buikspieren interfereren met de analyse van de klier (Figuur 2D).
Voor de oxytocine-test, is het belangrijk om de zogende pups te scheiden van de dam voor dezelfde hoeveelheid tijd op elke gelegenheid. Op deze manier zul je ervoor zorgen dat er geen melk of kleine hoeveelheden melk aanwezig is in de leidingen voorafgaand aan de oxytocine blootstelling, maar ook dat voldoende melk aanwezig is in de longblaasjes, dat kan in de kanalen worden uitgeworpen door myo contracties (Figuur 3A) . Als pups zijn te snel verwijderd, kan melk ophopen in de longblaasjes en in de kanalen waardoor de werking van oxytocine moeilijk te controleren (Figuur 3B). Als alternatief, als het experiment is te vroeg uitgevoerd na pup verwijdering, zal melk geen tijd te accumuleren in de longblaasjes en oxytocine geïnduceerde contracties van myo cellen genoeg melk vrijkomen niet geactiveerd in de kanalen in acht te nemen (Figuur 3C).
Figuur 1. Mouse borstklier dissectie. Speld de muis op zijn rug door de vier ledematen (A). Snijd de huid eerst van de buik tot aan de nek. Maak dan loodrecht sneden van het midden van de buik aan elke ledemaat, zoals blijkt uit de stippellijn (B). Haal voorzichtig van de huid aan de zijkant van het dier en speld, het blootstellen van de melkklieren (C).
Figuur 2. Mouse borstklier ganse berg. Epitheel kanalen (pijlen) en de lymfeklier (pijlpunt) zijn gemakkelijk waargenomen in een mooi verspreid melkklier hele berg van klier # 4 (A). Een slecht verspreid melkklier kunnen worden los van de glijbaan en stortte in, waardoor deze onbruikbaar wordt (B). Een onjuist weggesneden borstklier kan hebben ontbrekende onderdelen (C) of stukken van spieren of de huid overige (D). Merk op dat de 2 e en 3 e klieren zijn spieren interdigitated, maar kan nog steeds gebruikt worden voor het ganse berg of histologie.
Figuur 3. Oxytocine-geïnduceerde melk ejectie kan worden waargenomen in epitheel leidingen (pijlen) naar aanleiding van oxytocine blootstelling (A). Echter, als leidingen zijn al gevuld met melk (pijlen) aan het begin van de test te wijten aan een verkeerd lange periode van latentie na de laatste zogen van de pups, verdere accumulatie van melk in de leidingen (pijlen) na oxytocine blootstelling is moeilijk te observeren (B). Als alternatief, zal een korte latentie periode na pup zogen niet zorgen voor voldoende accumulatie van melk in de longblaasjes goed worden waargenomen in de leidingen (pijlen) na oxytocine blootstelling (C). Foto's werden genomen voor en na de oxytocine belichting met behulp van een numerieke camera (Cybershot, Sony).
Figuur 4. Schematische voorstelling van de hele montage en oxytocine behandeling assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ontwikkeling van de borstklier en functie zijn strak georkestreerd. Mutante muizen kan haven genmutaties die ontwikkeling van de borstklier en de functie de noodzaak benadrukt om klier architectuur 13,12 evalueren kunnen aantasten. Hele montage kan worden uitgevoerd zoals beschreven in dit artikel in alle stadia van ontwikkeling van de borstklier. Typisch, is de ontwikkeling van het epitheel beoordeeld op het begin van de puberteit (~ 4 weken oud), in het midden van de puberteit (~ 6 weken oud) en na de puberteit (~ 10-12 weken oud) 2,10. Bij deze fasen, de hoeveelheid kanaal vertakking, kan het aantal uiteinde knoppen en de lengte van de kanalen worden bepaald om de mate van ontwikkeling klier 14,15 kwantificeren. Ook is alveologenesis (ontwikkeling van de longblaasjes tijdens de zwangerschap), meestal bepaald op 2-3 punten tijdens de zwangerschap, de structurele veranderingen die zich voordoen tijdens de lactatie en involutie kunnen ook worden waargenomen en gekwantificeerd in hele berg klier voorbereidingen 16. Echter, de kwantificering van de hele mounts van de late zwangere en zogende muizen moeilijk zijn te wijten aan de dichtheid van het weefsel. Het wordt aanbevolen om hele berg te combineren met histologische analyses, vooral voor die fasen 12. Voor meer gedetailleerde histologische evaluatie, kan melkklieren worden verwijderd met behulp van hetzelfde protocol vermeld in dit rapport, in formaline gefixeerde en onderworpen aan hematoxyline en eosine kleuring. Hele mount kan ook worden paraffine ingebed en gebruikt worden voor histologie na imaging is uitgevoerd. Voor beide technieken, goede en fijne ontleding van de melkklieren is cruciaal. Als mutante muizen worden beoordeeld, is het belangrijk om deze muizen te vergelijken met de dichtstbijzijnde controle muizen mogelijk, aangezien verschillende muizenstammen kan verschillende side-of tertiaire-vertakkingen, of alveologenesis 17. Bijvoorbeeld, in vergelijking met BALB / c muizen, C57BL / 6 muizen vertonen minder bijwerkingen vertakking en alveologenesis 17,18. Daarom moet BALB / c muizen niet worden gebruikt als een controle voor genetisch gemodificeerde muizen gegenereerd op een C57BL / 6 muis achtergrond. Terwijl de hele montage geeft inzicht in grove defecten in de ontwikkeling, kan de functie van de borstklier ook moeten worden geëvalueerd met behulp van andere complementaire technieken.
De belangrijkste functie van de borstklier is om te produceren en melk te leveren aan pups. Deze processen vereisen niet alleen een goede differentiatie van secretorische luminal cellen tijdens de zwangerschap, maar ook de coördinatie en efficiënte contracties van de myo-cellen rond de alveoli en langs de kanalen voor melk vervoer 8. Terwijl de melkproductie en-kwaliteit kan worden geëvalueerd door analytische beoordeling van de samenstelling van de melk 12, onder andere, de oorzaken van de verminderde melk levering aan de pups is moeilijker te evalueren. Inderdaad, kan de waargenomen afwezigheid van melk in de magen van de pasgeboren pups worden gekoppeld aan tal van gebreken, zoals een verminderde melkproductie, het onvermogen van de pups te zogen, gedrags-defecten van de moeder of melk ejectie gebreken. Een manier om te evalueren melkwagen en uitworp van gebreken uit de alveoli in de kanalen is het induceren van myo contracties met behulp van oxytocine, zoals beschreven in dit artikel. Echter, kwantificering van melkwagen en ejectie is moeilijk omdat het effect van oxytocine ex vivo is snel (meestal melk kan worden waargenomen in de kanalen binnen 1 minuut na de blootstelling), zelfs bij gebruik van een lage fysiologische doses oxytocine 10. Zo kan een klein verschil in de efficiëntie van de melkafgifte tussen twee muis lijnen niet waarneembaar zijn met deze techniek. Het kwantificeren van deze reactie is moeilijk, maar een semi-kwantitatieve manier van beoordelen van oxytocine geïnduceerde melk ejectie is om de respons te bestuderen onder verschillende doseringen en op de behandeling tijd nodig om kanalen te vullen met melk te bepalen. . In alle gevallen, de consistentie van de wachttijd tussen de laatste pup zuigeling naar het begin van de test is van cruciaal belang. Voor een meer accurate kwantificering van de lactatie of identificatie van een melk uitwerpen defect, deze methode kan worden aangevuld met de kwantificering van melk eiwitten en signaalwegen, zoals β-caseïne en Stat5, respectievelijk, of in vitro myo cel krimp na oxytocine blootstelling 19 .
Samengevat, transgene muis modellen zijn belangrijk en veel gebruikt voor het bestuderen van borstklier functie en ontwikkeling, en de rol van belangrijke genen te beoordelen in deze processen. De architectuur van de borstklier epitheel kan gemakkelijk worden waargenomen in de juiste weggesneden klieren met behulp van ganse berg in alle stadia van de ontwikkeling. Terwijl het geven van borstvoeding gebreken die leiden tot ondervoeding pups kan vele oorzaken, kan een tekort aan melk uitwerpen worden beoordeeld door oxytocine geïnduceerde gesynchroniseerde samentrekking van myo-epitheelcellen in situ. Samen kunnen deze twee technieken (figuur 4) geeft belangrijke inzichten in het effect van specifieke gen mutagen of deleties op de ontwikkeling van de borstklier en functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studies werden gefinancierd door CIHR en CBCRA beurzen aan DWL. IP werd gefinancierd door beurzen uit CIHR-STP, FRSQ en CIHR. MKGS werd gefinancierd door OGS en CIHR-STP beurzen. De auteurs danken Kevin Barr voor zijn hulp met de muis fokken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
References
- Geddes, D. T. Inside the lactating breast: the latest anatomy research. J Midwifery Womens Health. 52, 556-556 (2007).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8, 201-201 (2006).
- Silberstein, G. B., Flanders, K. C., Roberts, A. B., Daniel, C. W. Regulation of mammary morphogenesis: evidence for extracellular matrix-mediated inhibition of ductal budding by transforming growth factor-beta 1. Dev Biol. 152, 354-354 (1992).
- Daniel, C. W., Robinson, S., Silberstein, G. B. The role of TGF-beta in patterning and growth of the mammary ductal tree. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1, 331-331 (1996).
- Neville, M. C., Daniel, C. W. The Mammary gland : development, regulation, and function. , Plenum Press. New York. (1987).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, 207-207 (2006).
- Anderson, S. M., Rudolph, M. C., McManaman, J. L., Neville, M. C. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: it's not just about milk protein synthesis! Breast Cancer Res. 9, 204-204 (2007).
- Reversi, A., Cassoni, P., Chini, B. Oxytocin receptor signaling in myoepithelial and cancer cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, 221-221 (2005).
- Haslam, S. Z. Cell to cell interactions and normal mammary gland function. J Dairy Sci. 71, 2843-2843 (1988).
- Plante, I., Laird, D. W. Decreased levels of connexin43 result in impaired development of the mammary gland in a mouse model of oculodentodigital dysplasia. Dev Biol. 318, 312-312 (2008).
- Talhouk, R. S. Heterocellular interaction enhances recruitment of alpha and beta-catenins and ZO-2 into functional gap-junction complexes and induces gap junction-dependant differentiation of mammary epithelial cells. Exp Cell Res. 314, 3275-3275 (2008).
- Palmer, C. A., Neville, M. C., Anderson, S. M., McManaman, J. L. Analysis of lactation defects in transgenic mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 269-269 (2006).
- Howlin, J., McBryan, J., Martin, F. Pubertal mammary gland development: insights from mouse models. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 283-283 (2006).
- You, L. Modulation of mammary gland development in prepubertal male rats exposed to genistein and methoxychlor. Toxicol Sci. 66, 216-216 (2002).
- Grill, C. J., Cohick, W. S., Sherman, A. R. Postpubertal development of the rat mammary gland is preserved during iron deficiency. J Nutr. 131, 1444-1444 (2001).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes Dev. 12, 449-449 (1998).
- Aupperlee, Strain-specific differences in the mechanisms of progesterone regulation of murine mammary gland development. Endocrinology. 150, 1485-1485 (2009).
- Montero Girard, G. Association of estrogen receptor-alpha and progesterone receptor A expression with hormonal mammary carcinogenesis: role of the host microenvironment. Breast Cancer Res. 9, R22-R22 (2007).
- Moore, D. M., Vogl, A. W., Baimbridge, K., Emerman, J. T. Effect of calcium on oxytocin-induced contraction of mammary gland myoepithelium as visualized by NBD-phallacidin. J Cell Sci. 88, 563-563 (1987).
