Summary
Diese Methode beschreibt, wie zu sezieren und zu bewerten Brustdrüse Entwicklung und Funktion von Mäusen. Abgeschnittene Milchdrüsen sind für den Grad der Entwicklung mit whole mount beurteilt, während Milchspendereflex wird ausgewertet, wobei Oxytocin-basierte myoepithelialen Zelle Kontraktion Assay.
Abstract
Der menschliche Brustdrüse von 15-20 Lappen zusammengesetzt, die Sekretion von Milch in eine Verzweigung Kanalsystem Öffnung an der Brustwarze. Die Lappen selbst sind eine Reihe von Terminal Kanal lobulären Einheiten der sekretorischen Alveolen und konvergierenden Kanäle 1 zusammengesetzt. Bei Mäusen ist eine ähnliche Architektur an der Schwangerschaft in die Gänge und Alveolen in das bindegewebige Stroma eingestreut werden eingehalten. Die Maus Brustdrüse Epithel ist ein Baum wie Gangsystem aus zwei Schichten von Zellen, eine innere Schicht aus luminalen Zellen, die durch eine äußere Schicht aus Myoepithelzellen durch die Grenzen eines Basalmembran 2 bezeichnet umgeben ist. Bei der Geburt ist nur eine rudimentäre duktale Baum vorhanden ist, besteht aus einem primären Kanal und 15-20 Filialen. Niederlassung Dehnung und Verstärkung beginnen am Anfang der Pubertät, ca. 4 Wochen alt, unter dem Einfluss von Hormonen 3,4,5. Bei 10 Wochen, wird der Großteil des Stroma durch ein komplexes System von Kanälen, die Zyklen der Verzweigung und Regression in jeder Läufigkeit bis Schwangerschaft 2 wird zu unterziehen eingedrungen. Zu Beginn der Schwangerschaft, beginnt eine zweite Phase der Entwicklung, mit der Proliferation und Differenzierung des Epithels auf Trauben-förmige Milch sekretorischen Strukturen, so genannte Alveolen 6,7 bilden. Nach der Geburt und während der Stillzeit wird die Milch durch luminale sekretorische Zellen produziert und gelagert im Lumen der Alveolen. Oxytocin, ein neuronales Reflex Säugen der Welpen induzierte stimulierte, induziert synchronisiert Kontraktionen der Myoepithelzellen um die Alveolen und entlang der Kanäle, so dass Milch durch die Milchgänge zur Brustwarze, wo es verfügbar wird, um die Welpen 8 transportiert werden. Brustdrüse Entwicklung, Differenzierung und Funktion sind eng orchestriert und erfordern nicht nur Interaktionen zwischen Stroma und Epithel, sondern auch zwischen myoepithelialen und luminalen Zellen innerhalb des Epithels 9,10,11. Dabei können Mutationen in vielen Genen in diesen Interaktionen verwickelt beeinträchtigen entweder duktalen Dehnung während der Pubertät oder Alveolen Bildung in der frühen Schwangerschaft, Differenzierung während der späten Schwangerschaft und sekretorischen Aktivierung führt zu Laktation 12,13. In diesem Artikel beschreiben wir, wie man mit der Maus Milchdrüsen sezieren und beurteilen ihre Entwicklung mit ganzen mounts. Wir zeigen auch, wie man myoepithelialen Kontraktionen und Milchspendereflex mit einem ex-vivo Oxytocin-basierten funktionellen Assays zu bewerten. Der Effekt einer Genmutation auf Brustdrüse Entwicklung und Funktion kann also in situ, indem diese beiden Techniken in der Mutante und Wildtyp-Mäusen der Kontrollgruppe festgestellt werden.
Protocol
1. Brustdrüse Dissektion
- Euthanize der Maus unter Verwendung von CO 2-Inhalation. Vermeiden Sie Genickbruch, wenn möglich, da es große Blutgefäße im Hals und führen zu einer Akkumulation von Blut durch Brustdrüsen beschädigt werden kann, wodurch die Dissektion erschweren. Wenn jedoch andere Kriterien in die gleiche Maus, wie die Blutspiegel von Oxytocin ausgewertet werden sollen, können alternative Methoden Euthanasie notwendig sein, obwohl dies von Ihrem IACUC ausgewertet werden müssen.
- Auf einer Polystyrol-Hartschaum in Folie verpackt, die Maus auf den Rücken und breitete die vier Gliedmaßen. Pin fest aller vier Gliedmaßen mit 16 bis 20 Gauge-Nadeln (Abbildung 1A).
- Sprühen Sie die Maus großzügig mit 70% Ethanol.
- Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut an der Mittellinie und machen einen kleinen Schnitt mit einer scharfen Schere.
- Ausgehend von der Schnittführung, schneiden Sie die Haut bis zum Hals des Tieres unter Vermeidung Punktion der Bauch-oder Brusthöhle (Abbildung 1B).
- Schneiden Sie die Haut an den Vorderbeinen auf die Mittellinienschnitt, was zu einem "Y-Form" (Abbildung 1B). Schneiden Sie die Haut an den hinteren Gliedmaßen die gleiche Weise (Abbildung 1B).
- Mit hämostatischen Zange vorsichtig schälen die Bauch-und Brust-Haut auf die Seite der Maus. Wenn nötig, vorsichtig schneiden Bindegewebe.
- Fix die Haut um die Polystyrol-Hartschaum mit 16 bis 20 Gauge-Nadeln, Freilegung der Milchdrüsen an der Unterseite der Haut. Fahren und vollständige einseitig zu einer Zeit (Abbildung 1C).
- Mit einer Pinzette vorsichtig aus der Brustdrüse von Interesse und zwischen der Drüse und die Haut mit kleinen, scharfen Schere, beginnend von außen auf die Wirbelsäule des Tieres. Stellen Sie sicher, schneiden sorgfältig, so dass kein Stück Haut oder Muskeln bleiben auf der Drüse. Alle Brustdrüsen (Abbildung 1) kann mit Hilfe dieses Protokolls werden, aber Bauchschmerzen Brustdrüsen (# 4) sind am besten für die ganze Montage. Die 2. und 3. Drüsen haben einige verzahnte Muskeln und während sie für den ganzen Berg und Histologie verwendet werden können, könnten sie nicht angemessen für alle Analysen.
2. Whole mount
- Mindestens einen Tag vor der Präparation vorzubereiten carmine Alaun-Lösung durch Auflösen von 1 g Karmin und 2,5 g Aluminiumkaliumsulfat in 500 ml destilliertem Wasser und kochen für 20 Minuten in einem 1-Liter-Erlenmeyerkolben. Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml mit Wasser. Filter durch ein Whatman-Papier und eine kleine Menge von Thymol (einige Körner) als Konservierungsmittel. Kühlschrank. Nach der Färbung kann carmine Alaun-Lösung zurück zum Lager Flasche gegossen und wiederverwendet werden oft über mehrere Wochen. Machen Sie eine frische Lösung, wenn Farbe blass.
- Nach Auslösen der Brustdrüse der Maus (Schritt 1), breitete sie direkt auf einen Objektträger. Versuchen Sie es so viel wie möglich glätten, unter Beibehaltung der ursprünglichen Form in situ. Die Drüse wird auf der Folie schön bleiben, wenn sie richtig gespannt.
- Fix die Drüse durch Eintauchen, auf der Folie, in Carnoy Fixativ (100% EtOH, Chloroform, Eisessig; 6:3:1) für 4 Stunden im Abzug bei Raumtemperatur in einem Glas. Beachten Sie, dass andere haben 2 Stunden, die ausreichen zu sein scheint. Alternativ können Drüsen auch bei 4 ° C über Nacht behoben werden.
- Wash in 70% Ethanol für 15 min. Dann, allmählich rehydrieren in Wasser, indem die Hälfte der Ethanol-Lösung aus dem Glas und ersetzt sie durch ddH 2 O. Inkubieren für 5 min. Wiederholen Sie die 3-fache. Alternativ können Sie 70% - 35% - 15% - Ethanol und Wasser Bäder für jeweils 5 Minuten.
- Spülen in destilliertem Wasser für 5 Minuten.
- Färben in Carmin Alaun über Nacht bei Raumtemperatur. Anzumerken ist, dass Färbung könnte länger dauern, abhängig von der Dicke der Drüse sein.
- Nehmen Sie carmine Alaun Flecken die Wiederverwendung und allmählich austrocknen gefärbten Gewebeschnitten durch serielle Ethanol Bäder (50%, 70%, 95%, 100%) für jeweils 5 min und klar in Xylol oder in eine ungiftige Alternative wie Histo-clear, Übernachtung. Beide Entwässerung und Clearing kann auch eine längere Inkubationen mit dickeren Proben.
- Tauchen Brustdrüse in Methylsalicylat. Brustdrüsen kann in Methylsalicylat in einem Abzug aufbewahrt werden, bis Bilder bereit zu fassen sind.
- Bilder können in einem Abzug mit einer normalen Digitalkamera auf einem Stativ (verwenden Sie "Makro"-Funktion, wenn verfügbar), indem Sie die Dias auf einem Leuchttisch positioniert genommen werden. Verwenden Sie ein Binokular für höhere Vergrößerung. Alternativ können Milchdrüsen in Medien wie Permount montiert werden (nach Schritt 2,7) ermöglicht für Bilder außerhalb einer chemischen Abzugshaube auf jedem Imaging-Plattform bietet den Halterungen genommen werden sind ausreichend dünn.
- Um Brustdrüse Entwicklung mit whole mount, Messungen wie die Anzahl der Verzweigungen (oder Seite-Filialen) sowie Teile der Kanäle, die Länge des primären Kanälen, oder ein Verhältnis von Epithelzellen an Fettgewebe Bereich beurteilt werden zu quantifizieren. Endlich, nach fotografischen Dokumentationzung, Brustdrüse gesamte Halterung kann in Paraffin zum Schneiden und konventionellen histologischen Färbung eingebettet werden.
3. Oxytocin-induzierte Milchspendereflex
- Trennen Sie die Welpen von der Mutter nur, wenn sie gefüttert wurden. Warten Sie 1 Stunde vor dem Test.
- Sacrifice der Mutter und setzen die Brustdrüsen, wie zuvor beschrieben (Schritte von 1,1 bis 1,8), ohne sie aus dem Tier.
- Starten Sie den Test durch gleichmäßiges Ablegen entweder PBS oder der Oxytocin-Lösung direkt auf die Brustdrüse von Interesse, mit einem Transferpipette. Ein großes Spektrum von Dosen verwendet werden können; ~ 8 pg / ml (physiologische Dosis) wird in der Regel eingesetzt. Allerdings können hohe nicht-physiologischen Dosen (bis zu 1 mg / ml) verwendet werden, um das Fehlen der Reaktion in genetisch veränderter Mausmodelle zu gewährleisten. Für dieses Verfahren ist es empfehlenswert, Thorax (# 2-3) Drüsen zu benutzen, mit der einen Seite als Kontrolle (ausgesetzt PBS) und die andere Seite zu Milchspendereflex (Oxytocin Belichtung) zu testen.
- Inkubation für 1 Minute und entfernen Sie die Lösung durch vorsichtiges Absaugen mit einer Transferpipette. Milk Einstieg in die Kanäle kann durch Videoband oder durch Aufnahme von Bildern vor und nach der PBS oder Oxytocin Exposition überwacht werden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
In einem guten ganze Berg ist der Brustdrüse schön ausbreiten und das Epithel Kanäle sind leicht zu beobachten (Abbildung 2A). Wenn die Drüse ist nicht gut verteilt, kann es heben zum Teil oder ganz von der Folie, wenn in der Fixierlösung gelegt. Die Drüse wird dann hart und unbrauchbar (Abbildung 2B). Ebenso wird, wenn die Drüse nicht gut präpariert, entweder einen Teil des Epithels können fehlen (Abbildung 2C) bzw. der übrigen Teile der Haut oder der Bauchmuskel mit der Analyse der Drüse (Abbildung 2D) stören.
Für die Oxytocin-Assay, ist es wichtig, den Säugling Welpen aus der Talsperre für die gleiche Menge an Zeit bei jeder Gelegenheit zu trennen. Auf diese Weise werden Sie sicherstellen, dass keine Milch oder kleine Mengen von Milch in den Kanälen vor der Oxytocin-Exposition ist, sondern auch, dass genügend Milch vorhanden ist in den Alveolen, die in den Kanälen von myoepithelialen Kontraktionen (Abbildung 3A) ausgeworfen werden kann . Wenn Welpen zu früh entfernt werden, kann Milch in den Alveolen und in den Kanälen machen die Wirkung von Oxytocin schwer zu überwachen (Abbildung 3B) zu akkumulieren. Alternativ, wenn das Experiment ist zu früh, nach pup Entfernung durchgeführt wird Milch keine Zeit, um in die Alveolen und Oxytocin-induzierte Kontraktionen der Myoepithelzellen ansammeln wird nicht ausgelöst genug Milch Freisetzung in die Kanäle zu beobachten (Abbildung 3C) werden.
Abbildung 1. Maus Brustdrüse Dissektion. Pin mit der Maus auf dem Rücken durch die vier Gliedmaßen (A). Schneiden Sie die Haut zunächst aus dem Bauch bis zum Hals. Dann machen Sie senkrecht Einschnitte von der Mitte des Bauches, um jedes Glied, wie durch die gestrichelte Linie (B) dargestellt. Vorsichtig schälen die Haut auf der Seite des Tieres und stecken Sie es, Freilegung der Brustdrüse (C).
Abbildung 2. Maus Brustdrüse ganze Berg. Epithel Kanälen (Pfeile) und der Lymphknoten (Pfeilspitze) sind leicht in einem schön verteilt Brustdrüse ganzen Berg Drüse # 4 beobachtet (A). Ein schlecht verteilt Brustdrüse kann von der Folie ablösen und zusammengebrochen, wodurch es unbrauchbar (B). Ein falsch ausgeschnitten Brustdrüse kann entweder fehlende Teile (C) oder Stücke von Muskel oder Haut verbleibenden (D). Beachten Sie, dass die 2 nd und 3 rd Drüsen Muskel verzahnt, kann aber immer noch für ganze Berg oder Histologie verwendet werden.
Abbildung 3. Oxytocin-induzierte Milchspendereflex kann in Epithel Kanälen beobachtet werden (Pfeile) nach Oxytocin-Exposition (A). Allerdings, wenn Kanäle sind bereits mit Milch (Pfeile) am Anfang des Tests wegen einer unangemessen langen Latenzzeit nach der letzten Säugen der Welpen, weitere Akkumulation von Milch in den Kanälen (Pfeile) nach Oxytocin Exposition gefüllt ist schwer zu zu beobachten (B). Alternativ wird eine kurze Latenzzeit nach Welpen säugt nicht genug Ansammlung von Milch ermöglichen in die Alveolen richtig in die Gänge (Pfeile) werden nach Oxytocin-Exposition (C) beobachtet. Die Bilder wurden vor und nach Oxytocin-Exposition mit Hilfe eines numerischen Kamera (Cybershot, Sony) aufgenommen.
Abbildung 4. Schematische Darstellungen von ganzen Montage und Oxytocin Behandlung Assays.
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Discussion
Brustdrüse Entwicklung und Funktion sind eng orchestriert. Mutant Mäuse können Hafen-Gen-Mutationen, die Brustdrüse Entwicklung und Funktion Hervorhebung der Notwendigkeit, Drüse Architektur 13,12 bewerten beeinträchtigen können. Whole Montage kann wie in diesem Artikel auf allen Stufen der Brustdrüse Entwicklung beschrieben werden. Typischerweise wird die Entwicklung des Epithels zu Beginn der Pubertät (~ 4 Wochen alt) beurteilt, in der Mitte der Pubertät (~ 6 Wochen alt) und nach der Pubertät (~ 10-12 Wochen alt) 2,10. Auf diesen Stufen, die Höhe des Kanals Verzweigung, kann die Anzahl der terminalen Ende Knospen und Länge der Kanäle bestimmt werden, um den Grad der Drüse Entwicklung 14,15 quantifizieren. Ebenso ist alveologenesis (Entwicklung der Alveolen während der Schwangerschaft) in der Regel bei 2-3 Punkten in der Schwangerschaft bestimmt, die strukturellen Veränderungen, die während der Laktation und Involution auftreten können ebenfalls beobachtet und in whole mount Drüse Vorbereitungen 16 quantifiziert werden. Allerdings kann die Quantifizierung der ganzen mounts ab Ende schwangere und stillende Mäusen schwierig aufgrund der Dichte des Gewebes. Es wird empfohlen, ganze Berg mit histologischen Analysen zu kombinieren, vor allem für diejenigen Stufen 12. Für detaillierte histologische Beurteilung kann Brustdrüsen entfernt mit dem gleichen Protokoll in diesem Bericht erwähnt, in Formalin fixiert und einer Hämatoxylin und Eosin Färbung werden. Whole mount kann auch Paraffin eingebettet und verwendet für die Histologie einmal Bildgebung durchgeführt wurde. Bei beiden Verfahren ist die ordnungsgemäße und feinen Sezierung der Milchdrüsen von entscheidender Bedeutung. Wenn mutierten Mäusen beurteilt wird, ist es wichtig, dass diese Mäuse auf den nächsten Kontroll-Mäusen möglich zu vergleichen, da verschiedene Mausstämme variable Seiten-oder Tertiär-Verzweigungen, oder alveologenesis 17 zeigen kann. Zum Beispiel, wenn auf BALB / c-Mäusen verglichen, zeigen C57BL / 6 Mäusen reduziert Seitenverzweigung und alveologenesis 17,18. Daher sollten BALB / c Mäusen nicht als Kontrolle für genetisch veränderte Mäuse auf einem C57BL / 6 Maus Hintergrund erzeugt werden. Während ganze Montage bietet einen Einblick in grober Entwicklungsstörungen, kann die Funktion der Brustdrüse müssen auch unter Verwendung anderer ergänzender Techniken.
Die wichtigste Funktion der Brustdrüse zu produzieren und liefern Milch an Welpen. Diese Verfahren erfordern nicht nur korrekte Differenzierung der sekretorischen luminalen Zellen während der Schwangerschaft, sondern auch zu koordinieren und effizienter Kontraktionen der Myoepithelzellen um die Alveolen und entlang der Kanäle für Transport der Milch 8. Während Milchproduktion und-qualität durch analytische Beurteilung der Zusammensetzung der Milch 12 ausgewertet werden können, ist unter anderem die Ursachen beeinträchtigt Milch Auslieferung an den Welpen schwieriger zu bewerten. In der Tat kann die beobachtete Fehlen von Milch in den Mägen von neugeborenen Welpen zu viele Defekte wie Beeinträchtigung der Milchproduktion, die Unfähigkeit der Welpen zu säugen, Verhaltens-Defekte der Mutter oder Milchspendereflex Mängel verknüpft werden. Eine Möglichkeit, Milch Transport und Auswurf Mängel aus den Alveolen in die Gänge zu myoepithelialen Kontraktionen mit Oxytocin, wie in diesem Artikel beschrieben zu induzieren. Allerdings ist die Quantifizierung der Transport der Milch und Auswurf schwierig, da die Wirkung von Oxytocin ex vivo ist schnell (in der Regel Milch kann in den Kanälen innerhalb von 1 Minute nach der Exposition beobachtet werden), auch bei Verwendung von niedrigen physiologischen Dosen von Oxytocin 10. So könnte ein geringfügiger Unterschied in der Effizienz der Milchspendereflex zwischen zwei Mauslinien nicht beobachtbar mit dieser Technik werden. Die Quantifizierung dieser Antwort ist schwierig, aber man semi-quantitative Methode zur Beurteilung Oxytocin-induzierter Milchspendereflex ist es, die Reaktion unter einer Vielzahl von Dosierungen zu untersuchen und die Behandlung notwendige Zeit zu Leitungsrohren mit Milch füllen zu bestimmen. . In allen Fällen ist die Konsistenz der Wartezeit zwischen der letzten Welpen säugt an den Anfang des Tests kritisch. Für eine genauere Quantifizierung der Stillzeit oder die Identifizierung eines Milchspendereflex Defekt, kann diese Methode durch die Quantifizierung der Milchproteine und Signalwege, wie β-Casein und Stat5 bzw. ergänzt werden, oder in vitro myoepithelialen Zelle Kontraktion auf Oxytocin Belichtung 19 .
Zusammenfassend sind transgenen Mausmodellen wichtige und weit verbreitete für das Studium Brustdrüse Funktion und Entwicklung sowie auf die Rolle der wichtigsten Gene in diese Prozesse zu beurteilen. Die Architektur der Brustdrüse Epithel kann leicht in richtig ausgeschnitten Drüsen mit whole mount in allen Phasen der Entwicklung beobachtet werden. Während der Stillzeit Mängel, die zu Welpen Unterernährung viele Ursprünge haben kann, kann ein Mangel an Milchspendereflex durch Oxytocin-induzierter synchronisiert Kontraktion der Myoepithelzellen in situ beurteilt werden. Zusammen können diese beiden Techniken (Abbildung 4) wichtige Einblicke in die Wirkung von bestimmten Gen Mutationen gebengen oder Streichungen auf Brustdrüse Entwicklung und Funktion.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studien wurden von CIHR und CBCRA gewährt DWL finanziert. IP wurde durch Stipendien aus CIHR-STP, FRSQ und CIHR finanziert. MKGS wurde von OGS und CIHR-STP Stipendien finanziert. Die Autoren danken Kevin Barr für seine Unterstützung bei der Maus Zucht.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
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