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Biology

स्तन ग्रंथि और माउस मॉडल में विकास फंक्शन का मूल्यांकन

Published: July 21, 2011 doi: 10.3791/2828

Summary

इस विधि का वर्णन कैसे काटना और स्तन ग्रंथि और चूहों से विकास कार्य का आकलन है. Excised स्तन ग्रंथियों पूरे माउंट का उपयोग कर विकास की डिग्री के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं जबकि दूध इंजेक्शन एक ऑक्सीटोसिन आधारित myoepithelial सेल संकुचन परख का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन किया जाता है.

Protocol

1. स्तन ग्रंथि विच्छेदन

  1. सीओ 2 साँस लेना माउस का प्रयोग कर euthanize. यदि संभव हो तो ग्रीवा अव्यवस्था से बचें क्योंकि यह गर्दन और स्तन ग्रंथियों के आसपास रक्त के संचय में परिणाम में प्रमुख रक्त वाहिकाओं को नुकसान, विच्छेदन और अधिक मुश्किल प्रतिपादन हो सकता है. हालांकि, अगर अन्य मानदंडों को ऑक्सीटोसिन का रक्त स्तर के रूप में में एक ही माउस, में मूल्यांकन किया जाना है, वैकल्पिक इच्छामृत्यु तरीकों आवश्यक हो, हालांकि यह आपके IACUC द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए सकता है.
  2. एक polystyrene फोम पन्नी में लपेटा में, अपनी पीठ पर माउस जगह और चार अंग फैल. दृढ़ता से सभी चार अंगों का उपयोग 16 से 20 गेज सुई (चित्रा 1 ए) पिन.
  3. 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे उदारता.
  4. संदंश का प्रयोग, midline पर पेट की त्वचा को खींच और तेज कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाते हैं.
  5. चीरा से शुरू, त्वचा में कटौती जानवर की गर्दन जबकि उदर या वक्ष cavities (चित्रा 1 बी) puncturing से परहेज.
  6. कट सामने पैरों पर midline चीरा त्वचा, एक "वाई आकार" (चित्रा 1 बी) में जिसके परिणामस्वरूप. पीछे अंगों पर त्वचा उसी तरह कट (चित्रा 1 बी).
  7. Hemostatic संदंश धीरे पेट और वक्ष माउस के पक्ष में त्वचा छील, का उपयोग करना. यदि आवश्यक हो, धीरे संयोजक ऊतक में कटौती.
  8. Polystyrene फोम का उपयोग 16 से 20 गेज सुई, स्तन ग्रंथियों त्वचा के नीचे से जुड़ी उजागर करने के लिए त्वचा ठीक. आगे बढ़ना है और एक समय (चित्रा 1C) पर एक तरफ पूरी.
  9. संदंश का प्रयोग, धीरे से ब्याज की स्तन ग्रंथि उठा और ग्रंथि और छोटे तेज कैंची के साथ त्वचा के बीच में कटौती जानवर की रीढ़ की ओर बाहर से शुरू. सुनिश्चित करें कि आप ध्यान से कटौती, तो त्वचा या मांसपेशी का कोई टुकड़े ग्रंथि पर रहते हैं. सभी स्तन ग्रंथियों (चित्रा 1) इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर हटाया जा सकता है, लेकिन पेट की स्तन ग्रंथियों (# 4) पूरे बढ़ते के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं. 2 एन डी और 3 Rd ग्रंथियों कुछ interdigitated मांसपेशियों है और जबकि वे पूरे माउंट और ऊतक विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वे सभी विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है.

2. पूरे माउंट

  1. कम - से - कम एक विच्छेदन के लिए पहले दिन, आसुत जल और फोड़ा की 500 मिलीलीटर में 1 लीटर Erlenmeyer फ्लास्क में 20 मिनट के लिए लाल रंग की 1g और एल्यूमीनियम पोटेशियम सल्फेट के 2.5g भंग करके कामैन फिटकिरी समाधान तैयार है. 500 मिलीलीटर पानी के साथ अंतिम मात्रा समायोजित. फ़िल्टर एक वाटमान कागज के माध्यम से और एक परिरक्षक के रूप में थाइमॉल (कुछ अनाज) की एक छोटी राशि जोड़ने. सर्द. धुंधला के बाद, कामैन फिटकिरी समाधान शेयर बोतल को वापस डाला सकता है और कई हफ्तों से अधिक कई बार reused. एक ताजा समाधान करें जब रंग बेहोश हो जाता है.
  2. माउस (चरण 1) से स्तन ग्रंथि excising के बाद, यह सीधे फैल एक गिलास स्लाइड पर. इसे जितना संभव हो समतल, सीटू आकार में मूल रखने की कोशिश करें. ग्रंथि स्लाइड पर अच्छी तरह से छड़ी जब ठीक से बढ़ाया जाएगा.
  3. कमरे के तापमान पर एक जार में धूआं हुड में 4 घंटे के लिए, यह डुबो, स्लाइड पर, Carnoy लगानेवाला (6:03:01 100% EtOH, क्लोरोफॉर्म, हिमनदों एसिटिक एसिड) में ग्रंथि ठीक. नोट है कि दूसरों को 2 घंटे इस्तेमाल किया है जो करने के लिए पर्याप्त होना लगता है. वैकल्पिक रूप से, ग्रंथियों को भी 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर तय किया जा सकता है.
  4. 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में धो डालें. फिर, धीरे धीरे पानी में जार से इथेनॉल समाधान के आधे से हटाने और यह DDH 2 ओ के साथ जगह rehydrate 5 मिनट के लिए सेते हैं. 3 बार दोहराएँ. 5 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल और पानी स्नान - 35% - 15% वैकल्पिक रूप से, 70% का उपयोग करें.
  5. 5 मिनट के लिए आसुत पानी में कुल्ला.
  6. कमरे के तापमान पर कामैन फिटकिरी में रातोंरात दाग. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि धुंधला हो जाना अब ग्रंथि की मोटाई के आधार पर ले सकता है.
  7. कामैन फिटकिरी के लिए पुन: उपयोग करते हैं और धीरे - धीरे धारावाहिक इथेनॉल स्नान (50%, 70%, 95%, 100%) के माध्यम से प्रत्येक और xylene में स्पष्ट है, या histo स्पष्ट रूप में एक गैर विषैले वैकल्पिक में 5 मिनट के लिए दाग ऊतक निर्जलीकरण दाग निकालें रातोंरात. दोनों निर्जलीकरण और समाशोधन भी मोटा नमूनों के साथ अब incubations की आवश्यकता हो सकती है.
  8. मिथाइल सैलिसिलेट में विसर्जित स्तन ग्रंथि. स्तन ग्रंथियों एक धूआं हुड में मिथाइल सैलिसिलेट में रखा जा सकता है जब तक चित्र लिया जा करने के लिए तैयार हैं.
  9. छवियाँ ("मैक्रो" यदि उपलब्ध फ़ंक्शन का उपयोग करें) एक प्रकाश की मेज पर स्लाइड्स रखकर तिपाई पर तैनात एक नियमित रूप से डिजिटल कैमरा के साथ एक धूआं हुड में लिया जा सकता है. उच्च आवर्धन के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, स्तन ग्रंथियों Permount जैसे मीडिया में रखा जा सकता है (2.7 कदम के बाद) की अनुमति चित्रों के लिए किसी भी इमेजिंग mounts प्रदान मंच पर एक रासायनिक धूआं हुड के बाहर ले जाया पर्याप्त पतली हैं.
  10. आदेश में स्तन ग्रंथि विकास का उपयोग कर पूरे माउंट, असर (शाखाओं या पक्ष) की संख्या नलिकाओं के अंश के साथ, प्राथमिक नलिकाओं की लंबाई, या वसा ऊतकों के क्षेत्र को उपकला के अनुपात के रूप में इस तरह के मापन का मूल्यांकन किया जा सकता है मात्रा ठहराना करने के लिए. अंत में, फ़ोटो documen के बादtation, स्तन ग्रंथि पूरे माउंट सेक्शनिंग और पारंपरिक histological धुंधला हो जाना करने के लिए आयल में एम्बेड किया जा सकता है.

3. ऑक्सीटोसिन प्रेरित दूध इंजेक्शन

  1. बांध बस के बाद वे तंग आ गया है से अलग पिल्ले. परख प्रदर्शन से पहले 1 घंटे रुको.
  2. माँ बलिदान और पहले (1,1 करने के लिए 1.8 कदम) के रूप में वर्णित स्तन ग्रंथियों जानवर से उन्हें हटाने के बिना, बेनकाब.
  3. परख ब्याज की स्तन ग्रंथि पर समान रूप से सीधे या तो पीबीएस या ऑक्सीटोसिन समाधान छोड़ने, एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर प्रारंभ करें. खुराक की एक बड़ी स्पेक्ट्रम का इस्तेमाल किया जा सकता है; ~ 8 स्नातकोत्तर / एमएल (शारीरिक खुराक) आम तौर पर प्रयोग किया जाता है. हालांकि, उच्च गैर - शारीरिक खुराक (1 मिलीग्राम / एमएल) के आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल में प्रतिक्रिया के अभाव सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रक्रिया के लिए, यह वक्ष ग्रंथियों (# 2-3) का उपयोग करने के लिए, (पीबीएस उजागर करने के लिए) नियंत्रण और दूसरे पक्ष के रूप में एक तरफ का उपयोग करने के लिए दूध इंजेक्शन (ऑक्सीटोसिन जोखिम) का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है.
  4. 1 मिनट के लिए सेते हैं और ध्यान से यह एक अंतरण विंदुक के साथ aspirating द्वारा हल निकालने. नलिकाओं में दूध प्रविष्टि वीडियो टेप रिकार्डिंग के द्वारा, या पीबीएस या ऑक्सीटोसिन जोखिम से पहले और बाद में छवियों को लेने के द्वारा नजर रखी जा सकता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

एक अच्छा पूरे माउंट में, स्तन ग्रंथि अच्छी तरह से और फैल उपकला नलिकाओं को आसानी से (चित्रा 2A) नमूदार हैं. यदि ग्रंथि अच्छी तरह फैल नहीं है, यह भाग में या पूरी तरह से स्लाइड से जब लगानेवाला समाधान में रखा उठा सकता है. ग्रंथि तो मुश्किल और व्यर्थ (चित्रा 2B) हो जाएगा. इसी तरह, अगर ग्रंथि अच्छी तरह से dissected नहीं है, या तो उपकला के कुछ हिस्से (चित्रा 2C) लापता हो सकता है या त्वचा या पेट की मांसपेशियों के शेष भागों ग्रंथि (चित्रा 2 डी) के विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करेगा.

ऑक्सीटोसिन परख के लिए, यह हर अवसर पर समय की एक ही राशि के लिए बांध से दूध पिलाती पिल्ले को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह, आप यह सुनिश्चित कर लें होगा, कि कोई दूध या दूध की छोटी मात्रा में ऑक्सीटोसिन जोखिम से पहले नलिकाओं में मौजूद है, लेकिन यह भी है कि पर्याप्त दूध अलवियोली कि myoepithelial संकुचन (चित्रा 3A) द्वारा नलिकाओं में अलग हो सकता है में मौजूद है . यदि पिल्ले भी जल्द ही हटा रहे हैं, दूध अलवियोली और नलिकाओं (3B चित्रा) की निगरानी के लिए मुश्किल ऑक्सीटोसिन के प्रभाव प्रतिपादन में जमा कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, अगर प्रयोग बहुत जल्दी पिल्ला हटाने के बाद किया जाता है, दूध अलवियोली और myoepithelial कोशिकाओं के ऑक्सीटोसिन प्रेरित संकुचन में जमा (चित्रा 3C) मनाया जा नलिकाओं में पर्याप्त दूध विज्ञप्ति ट्रिगर नहीं करेगा के लिए समय नहीं होगा.

चित्रा 1
चित्रा 1 माउस स्तन ग्रंथि विच्छेदन. अपनी पीठ पर चार अंगों (ए) द्वारा माउस पिन. पेट से गर्दन के लिए पहले त्वचा कट. फिर पेट के प्रत्येक अंग के लिए केंद्र के रूप में बिंदीदार रेखा (बी) के द्वारा दिखाया गया है से सीधा चीरों बनाते हैं. जानवर की तरफ धीरे छील त्वचा और यह पिन, स्तन ग्रंथियों (सी) को उजागर.

चित्रा 2
चित्रा 2. माउस स्तन ग्रंथि पूरे माउंट. उपकला (तीर) नलिकाएं और लिम्फ नोड (arrowhead) आसानी से एक अच्छी तरह से फैल ग्रंथि के स्तन ग्रंथि पूरी माउंट # 4 में मनाया जाता है (ए). एक खराब फैल स्तन ग्रंथि स्लाइड से अलग हो सकता है और ध्वस्त हो गई, यह प्रतिपादन व्यर्थ (बी). एक अनुचित तरीके से excised स्तन ग्रंथि या तो लापता भागों (सी) या मांसपेशियों या त्वचा के टुकड़े शेष (डी) हो सकता है. ध्यान दें कि 2 एन डी और 3 ग्रंथियों तीसरी मांसपेशी interdigitated है, लेकिन अभी भी पूरी माउंट या ऊतक विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. ऑक्सीटोसिन प्रेरित दूध इंजेक्शन उपकला नलिकाओं में मनाया जा सकता है ऑक्सीटोसिन जोखिम (ए) के बाद (तीर) . हालांकि, अगर नलिकाओं पिछले पिल्ले, नलिकाओं में दूध के आगे संचय ऑक्सीटोसिन प्रदर्शन के बाद (तीर) का दूध पिलाती के बाद विलंबता के एक अनुपयुक्त लंबी अवधि के कारण परख की शुरुआत में पहले से ही कर रहे हैं दूध (तीर) से भरा करने के लिए कठिन है निरीक्षण (बी). वैकल्पिक रूप से, पिल्ला दूध पिलाती के बाद एक कम विलंबता अवधि ठीक से ऑक्सीटोसिन जोखिम (सी) के बाद नलिकाओं (तीर) में मनाया जा अलवियोली में दूध की पर्याप्त संचय के लिए नहीं की अनुमति देगा. छवियाँ ऑक्सीटोसिन एक संख्यात्मक कैमरा (Cybershot, सोनी) का उपयोग कर जोखिम से पहले और बाद में ले जाया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4 पूरे बढ़ते और ऑक्सीटोसिन उपचार assays के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.

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Discussion

स्तन ग्रंथि के विकास और समारोह कस करवाया जाता है. उत्परिवर्ती चूहों में जीन म्यूटेशनों कि स्तन ग्रंथि के विकास और समारोह ग्रंथि 13,12 वास्तुकला का मूल्यांकन करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला ख़राब कर सकते हैं बंदरगाह हो सकता है. पूरे बढ़ते के रूप में स्तन ग्रंथि के विकास के सभी चरणों में इस आलेख में वर्णित किया जा सकता है. आमतौर पर, उपकला के विकास यौवन (~ 4 सप्ताह पुराने) की शुरुआत में मूल्यांकन किया है, यौवन (~ 6 हफ्ते पुरानी) के बीच में और (~ 10-12 सप्ताह पुराने) 2,10 यौवन के बाद . इन चरणों में, वाहिनी शाखाओं में बंटी की राशि, टर्मिनल अंत कलियों और नलिकाओं की लंबाई की संख्या के क्रम में ग्रंथि 14,15 विकास की डिग्री यों निर्धारित किया जा सकता है . इसी तरह, alveologenesis (गर्भावस्था के दौरान अलवियोली के विकास) आमतौर पर गर्भावस्था के दौरान 2-3 बिंदुओं पर निर्धारित, संरचनात्मक परिवर्तन है कि स्तनपान और पेचीदगी के दौरान होते भी मनाया और पूरे माउंट ग्रंथि 16 तैयारी में कर सकते हैं मात्रा निर्धारित किया जा. हालांकि, देर से गर्भवती और स्तनपान कराने वाली चूहों से पूरे mounts की मात्रा का ठहराव ऊतक के घनत्व के कारण मुश्किल हो सकता है है. यह histological विश्लेषण के साथ विशेष रूप से उन 12 चरणों के लिए पूरी माउंट, गठबंधन की सिफारिश की है. और अधिक विस्तृत histological मूल्यांकन के लिए, स्तन ग्रंथियों ही इस रिपोर्ट में उल्लेख किया प्रोटोकॉल, formalin में तय की और hematoxylin और eosin धुंधला के अधीन का उपयोग कर हटाया जा सकता है है. साबुत माउंट भी आयल एम्बेडेड और ऊतक विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया एक बार इमेजिंग प्रदर्शन किया गया है किया जा सकता है. दोनों तकनीकों के लिए, स्तन ग्रंथियों की उचित और नाजुक विच्छेदन महत्वपूर्ण है. यदि उत्परिवर्ती चूहों का मूल्यांकन किया जा रहा है, यह महत्वपूर्ण है निकटतम नियंत्रण संभव चूहों के लिए इन चूहों की तुलना में, के बाद से विभिन्न माउस उपभेदों चर पक्ष या तृतीयक असर, या 17 alveologenesis दिखा सकते हैं. उदाहरण के लिए, जब BALB / ग चूहों की तुलना में, C57BL 6 / चूहों कम पक्ष शाखाओं में बंटी और alveologenesis 17,18 एक्ज़िबिट . इसलिए, BALB / ग चूहों आनुवंशिक रूप से संशोधित / 6 C57BL माउस पृष्ठभूमि पर उत्पन्न चूहों के लिए एक नियंत्रण के रूप में नहीं किया जा इस्तेमाल किया जाना चाहिए. जबकि पूरे बढ़ते सकल विकास संबंधी दोषों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, स्तन ग्रंथि के समारोह भी अन्य पूरक तकनीकों का उपयोग करते हुए मूल्यांकन किया जा आवश्यकता हो सकती है.

स्तन ग्रंथि के मुख्य समारोह के लिए उत्पादन और पिल्ले को दूध देने की है. इन प्रक्रियाओं को न केवल गर्भावस्था के दौरान स्रावी luminal कोशिकाओं के समुचित भेदभाव की आवश्यकता है, लेकिन अलवियोली के आसपास है और दूध 8 परिवहन के लिए नलिकाओं के साथ myoepithelial कोशिकाओं के संकुचन भी समन्वय और कुशल. जबकि दूध उत्पादन और गुणवत्ता दूध 12 संरचना के विश्लेषणात्मक मूल्यांकन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, दूसरों के बीच में, बिगड़ा दूध पिल्ले को प्रसव के कारणों का मूल्यांकन करने के लिए कठिन है . वास्तव में, नवजात शिशु पिल्ले के पेट में दूध की मनाया अभाव बिगड़ा दूध उत्पादन, पिल्ले की असमर्थता के लिए दूध पिलाना, माँ या दूध इंजेक्शन दोष के व्यवहार दोष के रूप में कई दोष से जोड़ा जा सकता है. अलवियोली से नलिकाओं में दूध परिवहन और इंजेक्शन दोष का मूल्यांकन करने का एक तरीका myoepithelial ऑक्सीटोसिन, के रूप में इस अनुच्छेद में वर्णित का उपयोग संकुचन प्रेरित है. हालांकि, दूध परिवहन और इंजेक्शन की मात्रा का ठहराव के लिए मुश्किल है के बाद से ऑक्सीटोसिन पूर्व vivo का प्रभाव तेजी से (आम तौर पर दूध प्रदर्शन के बाद 1 मिनट के भीतर नलिकाओं में मनाया जा सकता है) है, तब भी जब 10 ऑक्सीटोसिन का कम शारीरिक खुराक का उपयोग कर. इस प्रकार, दो माउस लाइनों के बीच दूध इंजेक्शन की दक्षता में एक मामूली अंतर इस तकनीक का उपयोग नहीं किया जा नमूदार हो सकता है. इस प्रतिक्रिया बढ़ाता मुश्किल है, लेकिन ऑक्सीटोसिन प्रेरित दूध इंजेक्शन का आकलन करने के एक अर्द्ध मात्रात्मक तरीका dosages के एक किस्म के तहत प्रतिक्रिया की जांच और उपचार के दूध के साथ नलिकाओं भरने के लिए आवश्यक समय निर्धारित है. . सभी मामलों में, पिछले परख की शुरुआत करने के लिए दूध पिलाती पिल्ला के बीच प्रतीक्षा अवधि की निरंतरता महत्वपूर्ण है. स्तनपान या एक दूध इंजेक्शन दोष की पहचान की एक ज्यादा सटीक मात्रा का ठहराव के लिए, इस विधि दूध प्रोटीन और β कैसिइन और Stat5, क्रमशः के रूप में संकेत दे रास्ते, की मात्रा का ठहराव से पूरित किया जा सकता है है, या इन विट्रो myoepithelial सेल संकुचन में ऑक्सीटोसिन 19 जोखिम पर .

सारांश में, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल स्तन ग्रंथि समारोह और विकास का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, और इन प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण जीनों की भूमिका का आकलन. स्तन ग्रंथि उपकला की वास्तुकला आसानी से ठीक excised विकास के सभी चरणों में पूरी माउंट का उपयोग ग्रंथियों में मनाया जा सकता है. जबकि स्तनपान पिल्ले कुपोषण के प्रमुख दोष कई मूल हो सकता है, दूध इंजेक्शन में एक कमी ऑक्सीटोसिन प्रेरित स्वस्थानी में myoepithelial कोशिकाओं के सिंक्रनाइज़ संकुचन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है . साथ में, इन दो तकनीकों (चित्रा 4) विशिष्ट जीन म्युटा के प्रभाव में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि दे सकते हैंमाहौल या स्तन ग्रंथि के विकास और समारोह पर विलोपन.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इन अध्ययनों CIHR और DWL के लिए CBCRA अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. आईपी ​​CIHR एसटीपी, FRSQ और CIHR से फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था. MKGS OGS और CIHR - एसटीपी छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों माउस प्रजनन के साथ अपनी सहायता के लिए केविन बर्र धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carmine Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate Sigma-Aldrich A6435
Thymol Sigma-Aldrich T0501
Methyl salicylate Sigma-Aldrich M6752
Oxytocin Sigma-Aldrich O3251

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References

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Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828, doi:10.3791/2828 (2011).

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